WWW.RU.I-DOCX.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные документы
 

Pages:   || 2 |

«Металлсвязывающая активность низкомолекулярных некрахмальных полисахаридов ...»

-- [ Страница 1 ] --

Государственное бюджетное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Макарова Ксения Евгеньевна

Металлсвязывающая активность низкомолекулярных некрахмальных полисахаридов

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Хотимченко Ю.С.

Владивосток-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………….. 4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Современные методы терапии интоксикаций тяжелыми металлами…….

9

1.1. Проблема загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами и способы ее решения………………………………………………………..... 9

1.2. Влияние тяжелых металлов на здоровье человека: острые и хронические отравления ………………………………………..…………... 15

1.3. Терапия и профилактика хронических и острых интоксикаций тяжелыми металлами ……………………………………………………...... 17

1.4. Получение низкомолекулярных пектинов и альгинатов ……………… 21

Заключение………………………………………………………………....... 29

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………….

31



2.1. Характеристика экспериментальных образцов………………………... 31

2.2. Получение низкомолекулярных некрахмальных полисахаридов......... 32

2.2.1. Гидролиз пектинов и альгинатов ……………….....…...……………. 32

2.2.2. Получение кальциевых солей пектинов и альгинатов...……………. 33

2.3. Стандартизация образцов пектинов и альгинатов …….…………......... 33

2.4. Определение констант связывания кадмия, свинца и ртути некрахмальными полисахаридами и препаратами сравнения in vitro…….. 38

2.5. Определение свинца в биологических образцах………………………. 41

2.6. Характеристика экспериментальных животных……………….…........ 42

2.7. Статистическая обработка результатов………………………….…….. 43

Глава 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ НЕКРАХМАЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ... 44

3.1. Получение пектинов……………………………………………………. 44

3.2. Получение альгинатов……………………………………..……………. 47

Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ЗАВИСИМОСТИ МЕТАЛЛСВЯЗЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ПЕКТИНОВ И АЛЬГИНАТОВ ОТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ

4.1. Свинецсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой in vitro………………………………………………... 50

4.1.1. Кинетика связывания свинца пектинами и альгинатами с различной молекулярной массой и препаратами сравнения…………………………... 50

4.1.2. Свинецсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой и препаратов сравнения при рН 2,0-6,0 52

4.2. Кадмийсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой in vitro.…………………………………

4.2.1. Кинетика связывания кадмия пектинами и альгинатами с различной молекулярной массой…...……………………………………..... 62

4.2.2. Кадмийсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой при рН 2,0-6,0

4.3. Ртутьсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой in vitro…………………..……………





4.3.1. Кинетика связывания ртути пектинами и альгинатами с различной молекулярной массой и активированным углем …...……………………… 71

4.3.2. Ртутьсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой и активированного угля при рН 2,0-6,0…………..... 73

Глава 5. ВЛИЯНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕКТИНОВ И АЛЬГИНАТОВ НА ЭКСКРЕЦИЮ СВИНЦА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ………………………………… 81

ОБСУЖДЕНИЕ……………………………………………………………… 91

ВЫВОДЫ…………………………………………………………………….. 99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………… 101

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Разработка новых лекарственных средств и поиск сырьевых источников фармацевтических субстанций представляют первостепенную задачу экспериментальной и клинической фармакологии. Актуальность этой задачи подчеркивается тем фактом, что в структуре фармацевтического рынка нашей страны отечественные производители лекарственных препаратов составляют менее 25%, и в ассортименте производимых препаратов крайне незначительна доля современных высокоэффективных лекарств [Хотимченко Ю.С., 2010]. Важным источником новых фармацевтических субстанций и лекарств являются природные соединения, их производные и синтетические аналоги, на основе которых, по разным оценкам, создается от 40 до 70% фармакологически активных веществ [Стоник В.А., Толстиков Г.А., 2008; Satheeshkumar N. et al., 2012; Bilecovа-Rabajdovа M. et al., 2013; Kaur K. et al. 2014]. Среди этих соединений обращают на себя внимание углеводные биополимеры, составляющие группу некрахмальных полисахаридов, к которым относят альгинаты, фукоиданы, каррагинаны и хитозаны, содержащиеся в основном в морских гидробионтах, и пектиновые вещества наземных растений и морских трав [Хотимченко Ю.С. и др., 2005; Caffall K.H., Mohnen D., 2009; Kumar V. et al., 2012].

Отличительным физиологическим свойством некрахмальных полисахаридов является их устойчивость к действию амилаз экзокринных желез млекопитающих, благодаря чему они не абсорбируются в тонкой кишке и не оказывают резорбтивные эффекты [Plaami S.P., 1997; Walsh M.C. et al., 2012]. Несмотря на это некрахмальные полисахариды обладают широким спектром фармакологических эффектов, таких как гастропротективный [Хасина Э.И. и др., 2003; Крылова С.Г. и др., 2009; Ефимова Л.А. и др., 2010], гепатопротективный [Сонина Л.Н., Хотимченко М.Ю., 2007; Li T.P., 2013; Hua Y. et al., 2014], нефропротективный [Хотимченко М.Ю. и др., 2008a, 2009], гиполипидемический [Metzger B.T. et al., 2009; Brouns F. et al., 2012; Jakobsdottir G. et al., 2013], иммуномодулирующий [Tsuji R.F. et al., 2003; Yoshikawa Y. et al., 2008] и некоторые другие. Благодаря низкой токсичности и возможности получения модифицированных производных с более высокой или принципиально новой фармакологической активностью растительные полисахариды рассматриваются в качестве потенциальных фармацевтических субстанций [Laurienzo P., 2010; Vasile C. et al., 2013; Pomin V.H., Mourаo P.A., 2014].

Вместе с тем, из обнаруженных эффектов некрахмальных полисахаридов наибольший интерес вызывает способность, прежде всего, пектинов и альгинатов взаимодействовать с тяжелыми металлами с образованием ионно-координационных связей между карбоксильными и гидроксильными группами пиранозных циклов уроновых кислот соседних полимерных цепей и ионом металла [Хотимченко Ю.С. и др. 2001а, б; Davis T.A. et al., 2003a, b; Khotimchenko M.Y. et al., 2007a,b, 2008a, b, 2010, 2012a, b; Khotimchenko Y.S. et al., 2012]. Это свойство позволяет использовать полиурониды для предупреждения всасывания токсичных металлов из кишечника в кровь и выведения депонированных в организме металлов, в том числе радионуклидов [Савченко О.В., Хотимченко Ю.С., 2002; Khotimchenko M.Y. et al., 2014]. Учитывая тот факт, что нативные полисахариды, выделенные из растений и водорослей, являются крупными молекулами, не способными абсорбироваться в кровь после орального применения, мы предположили, что уменьшение молекулярной массы полисахаридов увеличит их биодоступность и, возможно, повысит эффективность фармакологического воздействия. Для решения этих вопросов необходимо было на первых этапах изучить, как изменяются и в какую сторону фармакологические свойства низкомолекулярных полисахаридов в сравнении с их высокомолекулярными предшественниками.

Цель работы: исследовать металлсвязывающую активность низкомолекулярных пектинов и альгинатов и определить зависимость количественных параметров сорбции металлов от молекулярной массы полисахаридов.

Задачи работы:

1. Модифицировать метод получения низкомолекулярных пектинов и альгинатов.

2. Изучить кинетику связывания катионов свинца, кадмия и ртути низкомолекулярными пектинами и альгинатами и влияние на этот процесс рН реакционной среды.

3. Определить максимальную сорбционную емкость и аффинитет низкомолекулярных пектинов и альгинатов по отношению к катионам свинца, кадмия и ртути.

4. Провести сравнительный анализ сорбционных характеристик низкомолекулярных и высокомолекулярных пектинов и альгинатов, а также микрокристаллической целлюлозы, полифепана и активированного угля.

5. Исследовать влияние пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой на экскрецию катионов свинца в организме экспериментальных животных.

Научная новизна и теоретическое значение работы. В диссертационной работе проведен анализ зависимости сорбционной активности пектинов и альгинатов с их молекулярными массами. Экспериментальным путем in vitro определено влияние молекулярной массы пектинов и альгинатов на количественные параметры процесса сорбции катионов кадмия, свинца и ртути с применением математических моделей Лэнгмюра, Фрейндлиха и Брюне-Эммет-Теллера. Установлено, что с уменьшением молекулярной массы пектинов и альгинатов возрастает их связывающая активность по отношению к катионам свинца, кадмия и ртути. Наиболее эффективным сорбентом катионов кадмия и свинца является альгинат кальция с молекулярной массой 8,1 кДа, для катионов ртути – пектат кальция с молекулярной массой 6,8 кДа. Важное значение для процесса сорбции катионов тяжелых металлов низкомолекулярными пектинами и альгинатами имеет зависимость от рН среды. Альгинат кальция с молекулярной массой 8,1 кДа проявлял наибольший эффект по выведению катионов свинца по сравнению с другими исследованными полисахаридами в экспериментах на животных.

Практическая значимость. Проведенные исследования позволяют рекомендовать низкомолекулярные фракции пектинов и альгинатов для более глубокого изучения в качестве потенциальных лекарственных средств с целью выведения тяжелых металлов из организма. Модифицированный метод получения низкомолекулярных полисахаридов путем ступенчатого кислотного гидролиза позволяет получить пектины и альгинаты с молекулярной массой 1-10 кДа и 10-20 кДа, увеличить их выход и предотвратить деградацию полисахаридов за счет увеличения исходной концентрации и снижения времени контакта с гидролизующим агентом. Метод может быть использован для получения новых фармакологических субстанций на основе некрахмальных полисахаридов.

Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре фармации ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России («Приложение 1»).

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены и обсуждены на Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, 2010, 2013), научно-практической конференции «Первые Международные Беккеровские чтения» (Волгоград, 2010), на отчетной конференции в рамках Целевой комплексной программы фундаментальных научных исследований в ДВО РАН на период 2008-2012 гг. «Получение, исследование и моделирование биогенных и биомиметических наноструктурных материалов» (Владивосток, 2010), на Международной виртуальной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (Красноярск, 2012), на Международной научно-практической конференции «Теория и практика актуальных исследований» (Краснодар, 2012), на Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012 года), на XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных положений дисертации.Основные положения, выносимые на защиту:

Взаимодействие низкомолекулярных полисахаридов с катионами свинца, кадмия и ртути происходит в соответствии с сорбционными моделями Лэнгмюра и Фрейндлиха. При снижении молекулярной массы пектинов и альгинатов увеличивается их связывающая активность по отношению к катионам свинца, кадмия и ртути.

Применение низкомолекулярных пектинов и альгинатов достоверно повышает экскрецию ионов свинца у экспериментальных животных по сравнению с высокомолекулярными полисахаридами.

Личный вклад автора. Автором выполнен основной объем работ по обобщению литературных данных по теме диссертации, разработан дизайн экспериментов, спланированы и проведены опыты по установлению металлсвязывающей активности in vitro и оценке влияния некрахмальных полисахаридов на экскрецию свинца in vivo, систематизированы, статистически обработаны и проанализированы экспериментальные данные. Метод получения низкомолекулярных полисахаридов модифицирован совместно со старшим научным сотрудником лаборатории фармакологии Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН Ковалевым В.В.

Объем и структура диссертации. Диссертация представлена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы.

Работа иллюстрирована 36 рисунками и 12 таблицами. Библиография состоит из 254 отечественных и зарубежных источников.

Глава 1

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Современные методы терапии интоксикаций тяжелыми металлами

1.1. Проблема загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами и способы ее решения

Тяжелые металлы занимают второе место по степени опасности, уступая пестицидам и значительно опережая такие широко известные загрязнители, как диоксиды углерода и серы. В перспективе они могут стать более опасными, чем отходы атомных электростанций и твердые бытовые отходы [Водяницкий Ю.К. и др., 2009; Begum A. et al., 2009].

Термин «тяжелые металлы» характеризует широкую группу загрязняющих веществ. В работах, посвященных проблемам загрязнения окружающей среды и экологическому мониторингу, к ним относят более 40 элементов периодической системы Д.И. Менделеева с атомной массой свыше 40 атомных единиц: хром, марганец, железо, кобальт, никель, медь, цинк, кадмий, ртуть, свинец, висмут и другие. Наиболее опасными, неразлагающимися элементами, токсичными даже в следовых количествах, согласно Международным пищевым стандартам (Codex Alimentarius), принятым ВОЗ, являются ртуть, кадмий, свинец, мышьяк, кобальт, ванадий и молибден. В настоящее время в Российской Федерации СанПин 2.3.2.1078-01 нормирует содержание только 4 токсичных элементов: свинца, ртути, кадмия и мышьяка (их относят к первой группе особо опасных веществ) в следствии их токсичности, а также широкого применения в промышленном производстве [Al-Saleha I. et al., 2011; Khanh P. et al., 2012; Великанова Н.А. и др., 2012].

Проблема загрязнения окружающей среды ионами тяжелых металлов далека от решения как в развивающихся, так и в развитых странах. В РФ густонаселенные, промышленно развитые районы, составляющие около 15% всей территории страны, имеют неудовлетворительное экологической состояние. Удельные показатели негативных воздействий на окружающую среду в расчете на душу населения и единицу валового внутреннего продукта в нашей стране одни из самых высоких в мире [Cherp A. et al.,2003; Shcheglova A.I. et al., 2013]. Эпидемиологические исследования показали, что около 1 млн. детей и взрослых экспонированы к дозам малой интенсивности свинца и ртути, около 44% детей в крупных промышленных центрах могут иметь повышенное содержание токсикантов в крови и около 1,0% нуждаются в неотложном лечении [Окина О.И. и др., 2009; Серегина И.Ф. и др., 2010].

Исследования, проведенные в США с 1970 по 2012 гг. показали, что не смотря на все меры по снижению выбросов свинца в окружающую среду, уровень его содержания в урбанизированных районах остается стабильно высоким [Datko-Williams L. et al., 2014]. Как следствие, более 1 млн. американских рабочих-строителей подвергаются воздействию повышенных доз свинца и других тяжелых металлов [Levin S.M., Goldberg M., 2000]. В крови около 500 тыс. детей в возрасте до 5 лет (4,4% от общего числа детей этого возраста) наблюдается повышенное содержание свинца [Rogan W.J., Ware J.H., 2003].

В Китае загрязнение почв тяжелыми металлами в связи с высокими темпами индустриализации и быстрой урбанизацией приобретает все большие масштабы [Ren W. et al., 2014]. Согласно исследованиям, проведенным в период 2005-2012 гг., содержание мышьяка, кадмия, хрома, меди, никеля, свинца, цинка и ртути превышает нормы Стандартов качества окружающей среды Grade II для почв в Китае (GB15618-1995) в среднем в 6,5, 36,5, 0,4, 2,1, 2,1, 2,1, 4,7, и 7,6 раза соответственно [Li Z. et al., 2014].

Исследования показывают, что содержание свинца, кадмия, меди, цинка и никеля в китайских овощах и рисе превышает допустимые санитарные нормы и, увеличивает риск развития хронических интоксикаций у граждан Китая и других стран, импортирующих данное продовольствие [Du Y. et al.,2013; Zheng J.et al., 2013].

Мониторинг содержания тяжелых металлов в окружающей среде, проводимый в Европе с 1990г с использованием мхов, показал, что высокие концентрации ртути наблюдаются в мхах Франции, Латвии, Словакии и Словении, алюминия, мышьяка, хрома, железа, никеля и ванадия – в восточной и южной Франции, сурьмы – в центральной и юго-восточной Великобритании, центральной Европе, северо-западной Франции и южной Норвегии. В то же время в данном регионе отмечается общее снижение уровня загрязнения окружающей среды мышьяком, кадмием, железом, свинцом и ванадием на 52-72%, медью, никелем и цинком на 20-30%, ртутью на 12% и хромом на 2%. Наиболее экологически безопасными по содержанию тяжелых металлов являются скандинавские страны, северные районы Великобритании и страны Балтии [Harmens H. et al., 2010]. Таким образом, страны Евросоюза на данный момент являются регионом с улучшающейся экологической обстановкой.

Общемировая тенденция в области экологии неутешительна, экологическая нагрузка на организм продолжает возрастать, а качество и безопасность воды, воздуха, почв и пищи неизменно снижаются. Решение проблемы в данных условиях может носить лишь комплексный характер и должно быть направлено одновременно на защиту организма от неблагоприятного влияния тяжелых металлов и ограничение их поступления в окружающую среду.

Основными источниками поступления тяжелых металлов в окружающую среду являются промышленность, автотранспорт, котельные, мусоросжигающие установки и сельскохозяйственное производство. К отраслям промышленности, загрязняющим окружающую среду, относятся черная и цветная металлургия, добыча и переработка углеводородов, горнообогатительные комплексы, стекольное, керамическое, электротехническое производство. В сельском хозяйстве загрязнение почвы тяжелыми металлами связано с использованием удобрений и пестицидов. Транспорт является источником более половины всех выбросов в атмосферу. Котельные, работающие на твердом и жидком топливе, загрязняют окружающую среду не только тяжелыми металлами, но и их оксидами. Сжигание мусора сопровождается поступлением в биосферу таких тяжелых металлов как кадмий, ртуть, свинец, хром [Wannaz E.D. et al., 2012; Naser H.A., 2013].

Свинец применяется при изготовлении аккумуляторов постоянного тока, кабельных оболочек, медицинской техники, хрусталя, в строительстве при изготовлении лакокрасочных изделий, уплотнителей для труб, возведении сейсмоустойчивых фундаментов, оптического стекла, многочисленных сплавов. Кроме того, тетраэтилсвинец долгое время оставался самым распространенным антидетонатором в топливе для двигателей внутреннего сгорания. С 2002 г в России свинецсодержащее топливо используется только в авиации [Viard B. et al., 2004; Paoliello M.M., De Capitani E.M. 2005; Parish C.N. et al., 2007; Stroud R.K., Hunt W.D., 2009; Tranel M.A., Kimmel R.O., 2009].

Кадмий применяется в ядерной энергетике, электронной и радиотехнической промышленности, а также при производстве аккумуляторов, сплавов и красок; его добавляют в пластик в качестве стабилизатора. В окружающую среду он попадает с отходами цветной металлургии и при производстве минеральных удобрений [Smirjakova S. et al., 2005], кроме того, вместе с другими тяжелыми металлами содержится в табачном дыме [Satarug S. et al., 2010; Чурилов А.В. и др., 2011].

Ртуть применяется при изготовлении батареек, флуоресцентных ламп, при производстве термометров и тонометров, оконных конструкций из поливинилхлорида. В медицинской практике ее используют для консервации вакцин, в аналитической химии и фармацевтическом анализе – в качестве реагента, в сельском хозяйстве – как протравитель семян и гербицид, в судостроении и судоремонте – как компонент краски морских судов. Самыми крупными источниками загрязнения окружающей среды ртутью являются угольные электростанции, золотодобывающая промышленность, цементные фабрики и предприятия, осуществляющие сжигание мусора и бытовых отходов [Clarkson T.W., Magos L., 2006; Петросян В.С., 2007].

Кроме антропогенных источников загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами существуют и естественные. Увеличение содержания металлов-токсикантов в поверхностных водах может происходить в результате кислотных дождей, приводящих к растворению горных пород, омываемых этими водами. Это загрязнение вызывает в биосфере (воздухе, воде, почвах, живых организмах) увеличение содержания тяжелых металлов по сравнению с фоновым уровнем [Calabrese S. et al., 2011; Suresh G. et al., 2011].

С целью предотвращения загрязнения воздуха, воды и почв тяжелыми металлами и радионуклидами промышленные предприятия оснащают специальными очистными сооружениями, при проектировании которых учитываются особенности загрязнения. Для удаления металлов используют химическое осаждение, коагуляцию, ионный обмен и жидкостную экстракцию, цементацию, комплексообразование, электрохимические операции, биологические операции, адсорбцию, выпаривание, фильтрацию, мембранные процессы, а также сочетание нескольких методов [Fu F. and Wang Q., 2011].

Применение ионообменных смол позволяет обеспечить не только глубокую очистку сточных вод, но и возвратить в производство ценные продукты. Примером может служить ионообменная технология, которая используется на предприятиях машиностроения и металлообработки [Shi W. et al., 2013; Song F. et al., 2013].

Экономически выгодным и безопасным методом очистки сточных вод и воздуха является микробиологическая утилизация. Методы такой очистки основаны на использовании специфических биологических сообществ, носящих общее название активного ила, для глубокой утилизации как органических, так и неорганических загрязнений. Известны штаммы микроорганизмов способные утилизировать оксиды, гидроксиды и комплексы тяжелых металлов, переводя их в менее токсичные соединения [Luo S. et al., 2014].

Для очистки сточных вод, сбрасываемых промышленными предприятиями, применяются модифицированные пектины и альгинаты, способные сорбировать свинец, медь, цинк и другие тяжелые металлы значительно снижая их концентрацию в воде [Li F.T. et al., 2007; Schiewer S., Patil S.B., 2008; Wai W.W. et al., 2010].

С целью удаления меди и кадмия из водных растворов применяют альгинат кальция и гранулы на основе геля с различными соотношениями альгината и пектина. Основным химическим механизмом данного процесса является ионный обмен [Cataldo S. et al., 2013].

На основе комплексного соединения пектина с оксидом железа получен нанокомпозитный сорбент (77 ± 5 нм в диаметре) обладающий высокой сорбционной активностью в отношении тяжелых металлов и применяемый для удаления меди (максимальная сорбционная емкость 48.99 мг/г) из водных растворов [Gong J. et al., 2012].

Эффективность применения биосорбентов на основе гранул альгината кальция показана в эксперименте с катионами меди, максимальное связывание которых наблюдалось при рН 5,5 с начальной концентрации катионов 275 мг/л и времени инкубации 50 мин. В данных условиях удавалось удалить 85,3% исходного металла, что делает данный метод перспективным для очистки сточных вод [Singh L. et al., 2012].

Применение пористого аэрогеля, содержащего в основном мезопоры, на основе альгината кальция приводило к увеличению сорбционной емкости на 20% и снижению времени, необходимого для достижения сорбционного равновесия в сравнении с непористыми аналогами, что можно объяснить увеличением площади активной поверхности гранул [Deze E.G. et al., 2012].

Для сорбции тяжелых металлов, таких как медь, кадмий, свинец, кобальт, никель, хром применяют наногель (диаметр 50 нм) и суперпарамагнитный нанокомпозит на основе альгината натрия, полученного путем его сополимеризации с оксидом железа (III) и тетранатрийтриакаликс(4)арен тетрасульфатом [Lakouraj M.M. et al., 2014].

Альгинаты находят применение в качестве субстрата для иммобилизации микроорганизмов (EM-1™ Inoculant), используемых для биосорбции хрома, меди и свинца. Исследование показывает, что иммобилизованные клетки связывают данные токсиканты эффективнее, чем свободные [Ting A.S.Y. et al., 2013].

Результаты исследований свидетельствуют о распространенности и высокой эффективности пектинов и альгинатов, в качестве индивидуальных сорбентов и компонентов комплексных соединений, применяемых для очистки промышленных выбросов от тяжелых металлов, что подтверждает их высокую эффективность и перспективность для дальнейшего исследования не только с экологической, но и с фармакологической направленностью.

1.2. Влияние тяжелых металлов на здоровье человека: острые и хронические отравления

Резкие выбросы отравляющих веществ в окружающую среду наблюдаются в случае техногенных катастроф, таких как авария на Чернобыльской АЭС и Фукусима-1, после которых радиоактивному загрязнению были подвержены вода, воздух, почва и продукты питания [Evangeliou N. et al., 2014; Onishi Y., 2014].

Аварии на промышленных предприятиях приводят к массовым случаям острых отравлений среди их сотрудников и жителей прилегающих территорий. Симптомы острых интоксикаций зависят от способа поступления отравляющего вещества в организм. При пероральных отравлениях первичные симптомы проявляются со стороны ЖКТ, к ним относятся тошнота, рвота, боли и диарея. Ингаляционные отравления возникают, например, при вдыхании паров ртути, в этом случае у пострадавших появляются кашель, одышка, бронхоспазм, развиваются пневмония, отек легких, а также поражение центральной нервной системы (угнетение сознания вплоть до оглушения, снижение зрения и слуха). Отравления всеми без исключения тяжелыми металлами приводят к поражению печени и почек [Muhammad S et al., 2011; Olawoyin R. et al., 2012; Liu X. et al., 2013; Rahman M.A. et al., 2014].

Хроническим интоксикациям отдельными тяжелыми металлами присущи более специфические симптомы. Описано массовое отравление кадмием жителей Японии, вызвавшее остеомаляцию, нефропатию, болезненность и переломы костей, получившее название болезни «Итай-Итай» [Nordberg D.F., 2009]. При хроническом кадмиозе поражаются мочевыводящая, половая и бронхолегочная системы, развивается анемия, повышается артериальное давление, отмечаются остеопластические и остеопорозные изменения костной ткани. Доказана роль кадмия в индукции рака легких и почек у курящих, развитии патологии предстательной железы [McKelvey W., 2007; Wong W.W. et al., 2008; Ильинских Н.Н. и др., 2011].

Характерными симптомами интоксикации свинцом являются расстройства пищеварения, потеря аппетита, острые боли в животе со спазмами абдоминальных мускулов («свинцовые колики»), изменения в составе крови (свинцовая анемия). На более поздних стадиях проявляются такие симптомы как головокружение, потеря ориентации и проблемы со зрением. Специфическое почернение («свинцовая линия») может появиться у основания десен. Возможен паралич («свинцовые судороги»), обычно затрагивающий в первую очередь пальцы и кисти рук [Ouldali O. et al., 2013]. У детей наблюдаются повреждения головного мозга, сопровождающиеся слепотой или глухотой, которые в тяжелых случаях заканчиваются летальным исходом [Шаров П.О., 2005; Fraser S. et al., 2006; Gonick H.C., 2008; Clark C.S. et al., 2009].

При хронических поражениях ртутью наблюдаются эмоциональная неустойчивость, раздражительность, снижение работоспособности, нарушение сна, дрожание пальцев рук, снижение обоняния, головные боли. Характерный признак отравления – появление по краю десен каймы сине-черного цвета, разрыхленность и кровоточивость десен, гингевит и стоматит [Моисеенко В.Г. и др., 2004; Guan R., Dai H., 2009; Koh C. et al., 2009; Рукавишников В.С. и др., 2011]. При отравлениях органическими соединениями ртути (диэтилмеркурофосфатом, диэтилртутью, этилмеркурохлоридом) преобладают признаки одновременного поражения центральной нервной и сердечно-сосудистой систем, желудка, печени и почек [Sarikaya S. et al., 2010]. Болезнь Минамата развивается при отравлении метиловой ртутью, ее основные проявления – нарушения координации, шаткость походки, дизартрия, гипестезия, нарушение жевания, глотания. При более тяжелых формах – тремор, потеря сознания, судороги.

Степень негативного влияния тяжелых металлов на организм зависит от химической формы, в которой токсикант попал в организм, дозы и продолжительности воздействия, возраста и состояния здоровья пострадавшего [Lukacinova A. et al., 2011]. Хронические интоксикации малыми дозами тяжелых металлов могут проявляться головной болью, усталостью, снижением иммунитета, что не всегда позволяет поставить точный диагноз и назначить лечение. У детей такие интоксикации приводят к дисбалансу эссенциальных элементов, снижению уровня физического развития, повышению частоты острых респираторных заболеваний, изменениям со стороны мочевыделительной, нервной, пищеварительной, сердечно-сосудистой систем, показателей красной крови.

Некоторые авторы связывают развитие рака у детей, проживающих в урбанизированных зонах, с высоким уровнем загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами [Absalon D., Slesak B., 2010]. Результаты недавних исследований элементного статуса у детей в возрасте от 1 до 8 лет с синдромом дефицита внимания и гиперреактивностью (СДВГ) показали вклад в патогенез этой патологии элементного дисбаланса [Llop S. et al., 2013]. К методам лабораторной диагностики, позволяющим установить точную причину недомогания прибегают крайне редко.

1.3. Терапия и профилактика хронических и острых интоксикаций тяжелыми металлами

В клинической токсикологии для оказания неотложной помощи при отравлениях тяжелыми металлами находят препараты-комплексоны: «Унитиол», «Купренил», «Натрия тиосульфат», «Сукцимер», «Тетацин-кальция», В состав этих соединений входят функциональноактивные группы, образующие с тяжелыми металлами хелатные связи.

Димеркаптопропансульфонат натрия («Унитиол», «Зорекс») является комплексообразующим средством, оказывающим дезинтоксикационное действие, за счет активных сульфогидрильных групп, взаимодействующих с катионами металлов и образующих с ними нетоксичные, водорастворимые соединения. Применяется в виде раствора для парентерального введения, связывает как тяжелые металлы, так и эссенциальные элементы [Bastrup-Madsen P., 1950; Mouret S. et al., 2013].

Пеницилламин («Купренил», «Артамин», «Бианодин») обладает высокой комплексообразующей активностью по отношению к металлам, главным образом к меди, ртути, мышьяку, свинцу, железу и кальцию за счет образования с ними стойких комплексных соединений, растворимых в воде и выводимых с мочой. Препарат уменьшает резорбцию тяжелых металлов из пищи и устраняет их избыток в тканях [Jang D. et al., 2011; Siatkowski R.M. et al., 2011; Bradberry S., Vale A., 2012 Naik R.M. et al., 2013].

Натрия тиосульфат обладает свойствами антидота за счет образования нетоксичных или малотоксичных соединений с солями тяжелых металлов, таких как неядовитые сульфиты мышьяка, ртути, свинца. При терапии интоксикации препарат назначают внутривенно.

Димеркаптоянтарная кислота («Сукцимер») и натрия кальция эдетат («Тетацин-кальция») обладают схожими с «Купренилом» и «Унитиолом» свойствами и показаниями к применению [Bradberry S., Vale A., 2012], но в России не применяются, так как данные препараты отсутствуют в Государственном реестре лекарственных средств.

Существенными недостатками препаратов-комплексонов являются влияние на обмен эссенциальных элементов и быстрое выведение токсикантов, приводящее ко вторичному поражению почек и других внутренних органов. Поэтому данные препараты используют только при острых отравлениях тяжелыми металлами под постоянным контролем за состоянием пациента со стороны медицинского персонала.

Описаны случаи применения высокомолекулярных пектинов и альгинатов для лечения хронических отравлений тяжелыми металлами у детей и взрослых. В исследованиях Транковской Л.В. показан положительный эффект биологически активных добавок «Полисорбовит-50» на основе высокомолекулярного пектина и «Детоксала-95» на основе высокомолекулярного альгината. У детей с нарушениями элементного гомеостаза наблюдались снижение содержания тяжелых металлов и улучшение состояния здоровья [Trankovskaya L.V. et al., 2002; Khotimchenko Y.S., 2003].

Исследование влияния степени этерификации высокомолекулярного пектина на металлсвязывающую активность доказало, что низкоэтерифицированный пектин является более эффективным сорбентом таких металлов, как медь, свинец, цинк, кадмий, железо в сравнении с высокоэтерифицированным пектином. Токсикологические испытания в остром и подостром токсиколого-гигиенических экспериментах низкоэтерифицированных пектинов, проведенные во Владивостокском государственном медицинском университете, показали, что данные биологически активные вещества безопасны при длительном пищевом использовании [Сергущенко И.С. и др., 2004; Khotimchenko M. et al., 2004а; Хотимченко Ю.С., 2006].

В нескольких городах США для лечения отравлений тяжелыми металлами использовали модифицированный цитрусовый пектин (МЦП) («PectaSol», EcoNugenics, Inc., Santa Rosa, CA) (от 5 до 15 г в день) и альгинат из бурых водорослей совместно с МЦП (по 450 и 300 мг в капсуле соответственно). Во всех описанных случаях наблюдалось снижение уровня тяжелых металлов и улучшение состояния здоровья, ни один из пациентов не сообщал о побочных явлениях, курс лечения составлял от 2 до 12 месяцев [Eliz I., 2007].

В Санкт-Петербургской педиатрической медицинской академии и в Институте токсикологии Министерства здравоохранения РФ были обследованы дети в возрасте 7-14 лет с повышенным уровнем ртути в моче. В качестве сорбента в течении 60 дней использовали яблочный пектин «Classic AU-701». В результате полного исчезновения ртути в моче к концу лечения удалось добиться у 82,2 % детей. На фоне сорбции пектином происходило повышение уровня гемоглобина и эритроцитов, снижение уровня ретикулоцитов, улучшение показателей лейкоцитарной формулы, клеточного и гуморального иммунитета. Авторы отметили, что под влиянием пектина формировался физиологический тип выделения ртути, который исключает возможность «ртутного обвала» и вторичного поражения мочевыводящих путей, наблюдаемых при хелатной терапии [Типсина Н.Н. и др., 2003; Соболев М.Б., 2004]. Следовательно, пектин являетя эффективным при меркуриализме.Функциональные нагрузочные пробы показали, что применение пектина не вызывает нарушений белкового, жирового и минерального обменов и биохимических показателей крови. Пектиновые вещества могут быть применены для повышения токсикорезистентности организма при химической нагрузке [Петракова М.Ю. и др., 2006; Парахонский А.П., 2009].

В диссертационной работе Хотимченко М.Ю. исследованы альгинаты натрия и кальция с молекулярной массой 403 кДа, пектины со степенью этерификации 60%, 40%, 20% и молекулярной массой 224 кДа, 70 кДа, 45 кДа, соответственно, деэтерифицированный пектин 20,5 кДа, пектат кальция 20,5 кДа и зостерин 62 кДа. Для данных некрахмальных полисахаридов изучены скорость протекания сорбционных процессов и зависимость сорбционной емкости связывающих материалов от длительности периода взаимодействия между сорбентом и сорбатом, описана сорбционная активность в отношении катионов меди, свинца, кадмия, цинка, ртути и стронция в сравнении с такими препаратами-энтеросорбентами, как активированный уголь, полифепан и микрокристаллическая целлюлоза с использованием математических моделей Лэнгмюра, Фрейндлиха и Брюне-Эммет-Теллера [Khotimchenko M. et al., 2004a, 2007a, b, 2008 a, b].

Показано, что увеличение степени этерификации молекулы пектина ведет к уменьшению его сорбционной емкости при взаимодействии с ионами любых металлов вследствии уменьшения коэффициента максимальной сорбционной емкости и снижением степени аффинитета [Хотимченко М. и др., 2006; Khotimchenko M. et al., 2007a, b; Khotimchenko M. et al., 2008a, b].

Для оценки металлсвязывающей активности солей альгиновой кислоты и пектинов с различной степенью этерификации in vivo автором проведены эксперименты с использованием лабораторных животных с моделированной свинцовой интоксикацией. Полученные результаты показали, что некрахмальные полисахариды существенно снижают накопление свинца во внутренних органах экспериментальных животных и ускоряют его выведение через желудочно-кишечный тракт [Khotimchenko M. et al., 2006; Serguschenko I. et al., 2007].

В исследованиях Хотимченко М.Ю. с соавторами подробно изучено влияние степени этерификации пектинов на их сорбционные свойства в отношении катионов тяжелых металлов in vitro, результаты которого подтверждены экспериментами in vivo. В то же время влияние молекулярной массы на сорбционные свойства некрахмальных полисахаридов остается не изученным, что и определило цели и задачи данного исследования.

1.4. Получение низкомолекулярных пектинов и альгинатов

До настоящего времени во всех исследованиях, посвященных сорбционным свойствам пектинов и альгинатов в отношении ионов тяжелых металлов и радионуклидов, использовались природные и модифицированные полисахариды с молекулярной массой более 40 кДа. Данные полисахариды обладают неоднородной структурой, в составе которой имеются участки с различной степенью упорядоченности. Согласно современным представлениям способность к формированию связей с ионами металлов напрямую зависит от степени упорядоченности молекулярной структуры полимера. Можно предположить, что выделение из молекул полисахаридов отдельных участков с наиболее упорядоченной структурой путем направленного гидролиза позволит получить низкомолекулярные производные биополимеров с повышенной сорбционной способностью.

Существует следующая классификация некрахмальных полисахаридов в зависимости от молекулярной массы: высокомолекулярные (с молекулярной массой более 400 кДа), среднемолекулярными (более 30 кДа) и низкомолекулярные (менее 30 кДа) [Rybalkina O.Yu. et al., 2013]. Такое разделение носит условный характер и не является общепринятым, так как резкого изменения физико-химических свойств при снижении молекулярной массы не происходит. Нами было принято следующее разделение по молекулярной массе: низкомолекулярные некрахмальные полисахариды (молекулярная масса менее 10 кДа), среднемолекулярные некрахмальные полисахариды (молекулярная масса 10-20 кДа), высокомолекулярные некрахмальные полисахариды (молекулярная масса более 20 кДа). Низкомолекулярные и среднемолекулярные пектины могут быть объединены термином олигогалактурониды, так как основным структурным компонентом данной молекулы является галактуроновая кислота. Низкомолекулярные и среднемолекулярные альгинаты принято называть олигоуронидами, так как их основу составляют две уроновые кислоты – маннуроновая и гулуроновая.

Для получения олигогалактуронидов из высокомолекулярного полимера используют ферментативный [Popov S.V. et al., 2005), кислотный [Wong S.L., Lye E.J.D., 2008], перекисный и щелочной гидролиз, которому часто предшествует химическая модификация высокомолекулярного сырья. С этой целью применяют метод деметоксилирования остатков D-галактуроновой кислоты раствором натрия гидроксида или ферментным препаратом пектинметилэстеразой. Гидролиз высокомолекулярного пектина можно представить в виде схемы (Рисунок 1), наглядно демонстрирующей изменения в полимерной молекуле происходящие под действием гидролизующего агента.

Рисунок 1. Схема гидролиза высокомолекулярного пектина

Ферментативный гидролиз (Рисунок 2) отдельных участков пектиновой молекулы проводят в присутствии соответствующих пектиназ. Для гидролиза гомогалактуронана используют полигалактуроназу и пектинлиазу. Для рамногалактуронана применяют рамногалактуроназу, рамногалактуронанацетилэстеразу и арабиназу [Nikolic M.V., Mojovic L., 2008; Duvetter T. et al., 2009; Cheng A. et al., 2011; Vidhyasagar V. et al., 2013]. Обычно гидролиз проводят при 37°С и рН среды, соответствующему оптимуму работы фермента. Контроль за реакцией осуществляют по увеличению количества гидролизованных сахаров. Деактивацию пектиназ производят повышением температуры до 100°С с последующим отделением низкомолекулярной фракции ультрафильтрацией. Существенными недостатками данной методики являются высокая стоимость ферментов и возможность получения в качестве продуктов гидролиза в основном моно-, ди- и трисахаридов в силу специфики действия пектиназ.

Рисунок 2. Ферментативный гидролиз пектина

Щелочная деполимеризация является запатентованным способом получения олигогалактуронидов с молекулярной массой от 2 до 20 кДа. Согласно данной методике в качестве гидролизующего агента используют гидроксид натрия, которым обрабатывают суспензию пектина в 60% изопропаноле в течении 5 дней при 25°С или 2 дней при 40°С. Гидролизат отделяют фильтрованием, нейтрализуют и сушат. Полученный пектин является вспомогательным веществом в кулинарии.

К недостаткам данного метода следует отнести образование большого количества примесей при взаимодействии галактуроновой кислоты со щелочью. Вторым недостатком является длительность процесса гидролиза и широкий диапазон молекулярных масс пектинов в продукте [Kertesz Z.I., 1951].

Описаны методики кислотного гидролиза сильно разбавленных растворов пектина (0,5-2,0%). В качестве гидролизующего агента применяют эквивалентные количества минеральных (хлористоводородной, серной) кислот с концентрацией 10-12 М. Гидролиз проводят при нагревании до 80-100°С. Продолжительность процесса определяется требуемой молекулярной массой продукта и может продолжаться 12 ч и более. Полученный гидролизат охлаждают до комнатной температуры. Жидкую фазу, содержащую олигогалактурониды, отделяют от высокомолекулярного пектина центрифугированием при охлаждении до 4°С и относительном центробежном ускорении 20000 g в течение 30 минут. Из полученной жидкой фазы изопропанолом осаждают олигогалактурониды, осадок отделяют центрифугированием. Средняя степень полимеризации готового продукта 15 (2,6 кДа). Выход олигогалактуронидов составляет 33,9% от первоначального содержания галактуроновой кислоты [Vries R.P. et al., 2002; Bedouet L. et al., 2005; Wong W.W. et al., 2008; Михалева Н.Я. и др., 2010]

Применение метода ограничено в связи с низким выходом продукта и длительным процессом гидролиза, что существенно увеличивает стоимость полученных олигогалактуронидов. Кроме того, необходимы жесткие условия (величина относительного центробежного ускорения 20000g и температура 4°С) для создания которых требуется сложное оборудование и дополнительные затраты, что приводит к удорожанию процесса и готового продукта.

Запатентован способ получения низкомолекулярных пектинов термическим разложением высокомолекулярного полисахарида. Способ включает в себя нагревание 1% раствора пектина с рН 4,0-5,0 при 110°С в течение 30-60 мин, охлаждение раствора с последующим осаждением олигоуронидов изопропанолом. Полученный продукт на 95% состоит из олигогалактуронидов со степенью полимеризации 4-11 (0,7-2 кДа).

Недостатками данного способа являются низкий выход олигогалактуронидов и присутствие в гидролизате продуктов их разложения, так как при температуре более 100°С резко ускоряются процессы термического разложения олигогалактуронидов за счет разрыва пиранозного цикла, окисления, декарбоксилирования, образования фурфурола и его производных [Kertesz Z.I., 1951]. С химической точки зрения олигогалактурониды, имеющие в составе молекул продукты термической деградации галактуроновой кислоты, не могут в полной мере считаться олигогалактуронидами.

В качестве окислителя для получения олигоуронидов (пектинов и альгинатов) также может быть использована перекись водорода. Гидролизу подвергается соль соответствующего некрахмального полисахарида, в качестве реагента используется 2% раствор перекиси водорода в присутствии сульфата железа. Процесс проходит в течении 4 часов, затем гидролизат осаждают уксусной кислотой, промывают пропанолом и сушат. Средняя степень полимеризации олигогалактуронидов - 16 (2,8 кДа).

Полученный данным способом гидролизат содержит примеси, образовавшиеся при деструкции остатков галактуроновой кислоты, что является существенным недостатком данного способа [Kertesz Z.I., 1951].

Для получения олигоуронидов из высокомолекулярных альгинатов могут быть использованы те же гидролизующие агенты, что и для пектинов: кислоты (серная, соляная, щавелевая) и перекись водорода при нагревании (менее 100°С или более 100°С) и комнатной температуре, а также ультрафиолетовый свет в присутствие катализатора. Гидролиз высокомолекулярного альгината можно представить в виде схемы, демонстрирующей структурные изменения молекулы (Рисунок 3).

При ферментативном разложении альгинатов используют фермент альгиназу (Рисунок 4). К пробе, содержащей альгинат, добавляют рассчитанное количество фермента в концентрации 50 мкг/мл, смесь инкубируют при температуре 30°С в течении нескольких часов, затем фермент может быть добавлен повторно. Для прекращения гидролиза к раствору прибавляют соляную кислоту до рН 4,0 и инкубируют 10 мин, после чего кислоту нейтрализуют гидроксидом натрия. Полученные образцы очищают последовательным пропусканием через хроматографическую колонку [Iwamoto I., 2003; Nomuro Y., 2009; Li J.W. et al., 2011]. Данный метод позволяет получить в качестве продуктов гидролиза в основном моно-, ди- и трисахариды, в силу специфичности работы фермента, что существенно ограничивает его применение.

М-блок – участок молекулы альгината состоящий только из остатков маннуроновой кислоты.

G-блок – участок молекулы альгината состоящий только из остатков гулуроновой кислоты.

МG- блок – участок молекулы альгината состоящий из остатков маннуроновой и гулуроновой кислот.

Рисунок 3. Схема гидролиза высокомолекулярного альгината

Для получения олигомеров может быть использован кислотный гидролиз в мягких условиях, при кратковременном нагревании суспензии альгиновых кислот в минеральных кислотах (20 мин, 100°С, 0,3 М HCl). При данных условиях в раствор переходит фракция олигомеров со средней степенью полимеризации ~20 [Усов А.И., 1999; Wang Y., 2006].

Метод характеризуется низким выходом готового продукта, обусловленным коротким временем взаимодействия альгината с гидролизующим агентом. Второй недостаток заключается в необходимости полного повторения всех технологических операций для повторного использования негидролизованного альгината, что увеличивает расход реагентов и стоимость процесса.

В качестве гидролизующего агента может быть использованы щавелевая и серная кислоты (в различных концентрациях 0,05, 0,15, 0,25 и 0,5M) с последующей обработкой суспензии альгината в микроволновой печи при частоте 2450 МГц в течении 4 минут [Chhatbar M. et al., 2009]. Гидролизат получаемый таким способом содержит продукты деструкции альгината, образовавшиеся за счет декарбоксилирования, разрыва пиранозного цикла и окисления спиртовых групп.

Рисунок 4. Гидролиз альгината

Термическое разложение раствора высокомолекулярного альгината с концентрацией 2% при температуре 180-240°С в течении 2-30 минут в трубке из нержавеющей стали (SUS316) объемом 6,0 см3 позволяет получить как моносахариды (маннуроновую и гулуроновую кислоты), так и олигоурониды, соотношение которых зависит от температуры и продолжительности гидролиза [Holme H.K. et al., 2003; Aida T.A. et al.,2010]. Основными недостатками данного метода является широкий диапазон молекулярных масс, полученных олигоуронидов и частичная деструкция продуктов, вызванная высокой температурой.

Для частичной деполимеризации альгината применяют фотохимическое разложение под действием ультрафиолета в присутствии катализатора диоксида титана. Водный раствор альгината натрия подвергают обработке при рН 7,0 в течение 3 часов. Продуктами данной реакции являются четыре фракции олигоуронидов, имеющие среднюю молекулярную массу [Burana J. et al., 2011]. В продуктах реакции присутствуют примеси, образующиеся в результате сопутствующих реакций.

Наличие у вышеописанных методов существенных недостатков делает актуальным их модификацию для получения олигоуронидов с заданными молекулярными массами (1-10 кДа и 10-20 кДа), не содержащих в своем составе примесей продуктов деструкции, снижения затрат на гидролиз и увеличения выхода готового продукта.

Заключение

Техногенные катастрофы, сопровождающиеся резкими выбросами в атмосферу ядовитых веществ в дозах, значительно превышающих предельно допустимые, приводят к острым отравлениям, проявляющимся характерными симптомами. Хронические интоксикации теми же веществами не имеют типичных симптомов и ослабляют организм в целом. Одними из таких токсикантов являются тяжелые металлы, их кумуляция в организме, помимо общего негативного влияния, оказывает канцерогенный, мутагенный, эмбриотоксический эффект. Поэтому важным направлением развития фармакологии является поиск эффективных и безопасных соединений, обладающих высокой металлсвязывающей активностью в отношении тяжелых металлов, для профилактики и лечения хронических интоксикаций. Большинство существующих препаратов могут быть использованы лишь при острых отравлениях ввиду наличия побочных эффектов.

Представленные в литературном обзоре данные доказывают эффективность и безопасность применения пектинов и альгинатов для профилактики и лечения интоксикаций тяжелыми металлами. Дальнейшее изучение взаимосвязи фармакологической активности и физико-химических характеристик (таких как молекулярная масса) пектинов и альгинатов открывает широкие перспективы, в том числе для создания высокоэффективных сорбентов обладающих металлсвязывающей активностью. В современной литературе отсутствуют сведения о влиянии молекулярной массы на сорбционные свойства пектинов и альгинатов в отношении тяжелых металлов.

Глава 2

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика экспериментальных образцов

В качестве исходного сырья для получения экспериментальных образцов низкомолекулярных полисахаридов использовали коммерческие цитрусовый пектин и альгинат натрия.

Высокоэтерифицированный пектин представлял собой однородный порошок кремового цвета, хорошо растворимый в воде, со степенью этерификации 58% и содержанием ангидрогалактуроновой кислоты (АГК) 74,3% и молекулярной массой 183 кДа (Herbstreith & Fox KG, Германия).

Пектат кальция с молекулярной массой 48,6кДа, содержанием АГК 69% и кальция 7,9% был получен из высокоэтерифицированного цитрусового пектина.

Из пектина с молекулярной массой 48,6 кДа были получены методом ступенчатого кислотного гидролиза пектат кальция с молекулярной массой 15,5 кДа, содержанием АГК 85,2% и кальция 8,3% и пектат кальция с молекулярной массой 6,8 кДа, содержанием АГК 84,9% и кальция 8,5%.

Коммерческий альгинат натрия представлял собой однородный порошок белого цвета, хорошо растворимый в воде с содержанием уроновых кислот 77,3% и молекулярной массой 403 кДа («Sigma», США).

Альгинат кальция с молекулярной массой 403 кДа, содержанием уроновых кислот 77,3% и кальция 7,25% был получен из альгината натрия путем реакции ионного обмена с хлоридом кальция.

Из альгината натрия с молекулярной массой 403 кДа были получены методом ступенчатого кислотного гидролиза альгинат кальция с молекулярной массой 18,0 кДа, содержанием уроновых кислот 86,2% и кальция 7,53% и альгинат кальция с молекулярной массой 8,1 кДа, содержанием уроновых кислот 85,9% и кальция 7,98%о.

В качестве препаратов сравнения применяли полифепан, активированный уголь и микрокристаллическую целлюлозу.

Полифепан (ООО «Сайнтек», Россия) – макропористый, аморфный порошок, получаемый путем глубокой переработки древесины хвойных пород, практически не растворим в воде. Неспецифический энтеросорбент на основе растительных полимеров (лигнин и гидроцеллюлоза).

Активированный уголь (ЗАО «Медисорб», Россия) – таблетки, измельченные в мелкий черный порошок без запаха и вкуса, получаемый путем термической обработки древесины различных пород. Адсорбирующее средство, обладающее большой поверхностной активностью и высокой сорбционной способностью. Практически не растворим в воде.

Микрокристаллическая целлюлоза (ЗАО «Эвалар», Россия) – таблетки белого цвета, измельченные в порошок, практически нерастворимый в воде. Биологически активная добавка к пище из измельченной и очищенной хлопковой целлюлозы.

2.2. Получение низкомолекулярных некрахмальных полисахаридов

2.2.1. Гидролиз пектинов и альгинатов

Образцы пектинов и альгинатов получали методом ступенчатого кислотного гидролиза в присутствии 0,5 М раствора соляной кислоты при температуре 90±0,5°С. Данный метод позволяет получать фракции со средневесовой молекулярной массой 1-10 кДа и 10-20 кДа. Процесс получения пектатов кальция включал в себя следующие стадии: деэтерификацию пектина, получение пектовой кислоты, два этапа гидролиза продолжительностью по 2 ч каждый, фракционирование продуктов гидролиза по молекулярным массам. Получение альгинатов кальция модифицированных по молекулярной массе включало следующие этапы: перевод альгината натрия в альгиновую кислоту, проведение предварительного гидролиза, проведение основного гидролиза альгината, фракционирование по молекулярным массам.

2.2.2. Получение кальциевых солей пектинов и альгинатов

Полученные в ходе гидролиза олигоурониды переводили в кальциевую форму путем реакции с эквивалентным объемом 1 М раствора хлорида кальция. Полученный осадок пектата кальция отделяли фильтрованием, промывали 70% этанолом и сушили при 80°С.

2.3. Стандартизация образцов пектинов и альгинатов

Стандартизацию образцов проводили по таким физико-химических параметрам, как среднечисловая и средневесовая молекулярная масса и молекулярно-массовое распределение, массовая доля ангидро-D-галактуроной кислоты для образцов пектата, массовая доля альгиновых кислот для образцов альгината, массовая доля кальция.

Для установления молекулярно-массового распределения использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии и метод концевых восстанавливающих групп. Для определения средневесовой молекулярной массы олигоуронидов применяли хроматографическую систему Shimadzu LC-20 AD с рефрактометрическим детектором RID-10A и светорассеивающим лазерным детектором ELSD-LTII. Разделение фракций осуществляли на колонке с гидрофильным полимерным сорбентом Shodex Asahipak GS-320 7E. Для пектатов в качестве элюента использовали 50 мМ ацетатно-аммиачный буфер при скорости элюирования 0,7 мл/мин. Для альгинатов элюентом служил 0,1 М раствор нитрата натрия при скорости элюирования 0,9 мл/мин при температуре 35С. Для оценки результатов предварительно калибровали колонку по стандартам пуллуланов с молекулярной массой 1,2, 3, 5, 10 и 20 кДа.

Образцы олигоуронидов и пуллуланов для проведения анализа готовили в концентрации 1 г/л. Молекулярную массу рассчитывали с помощью компьютерной программы 7GPC (Shimadzu, Япония). Хроматограммы исследованных образцов приведены на рисунках 9-12.

Рисунок 9. Хроматограмма пектата кальция с молекулярной массой 6,8 кДа.

Здесь и на рисунках 10-12 по оси абсцисс – время в мин, по оси ординат – изменение потенциала в мВ.

Рисунок 10. Хроматограмма пектата кальция с молекулярной массой 15,5 кДа.

Рисунок 11. Хроматограмма альгината кальция с молекулярной массой 8,1 кДа.

Рисунок 12. Хроматограмма альгината кальция с молекулярной массой 18,9 кДа.

Метод определения среднечисловой молекулярной массы пектатов и альгинатов по концевым восстанавливающим группам основан на реакции восстановления двухвалентной меди олигоуронидами при нагревании в присутствии арсеномолибденовой кислоты. Продуктом данной реакции является молибденова синь, интенсивность окраски которой измеряли фотометрически при 620 нм. Калибровочный график для расчетов строили в координатах: оптическая плотность при 620 нм – концентрация D-галактуроновой кислоты, мкМоль/л. В качестве стандарта использовали D-галактуроновую кислоту («Sigma», США). Среднечисловую молекулярную массу образца олигоуронида (Мn) в Да вычисляли по формуле:

(2)Mn=m*100-W*0,884*10000C*0,907*100, где

Мn – среднечисловая молекулярная масса образца олигоуронида;

m – масса навески олигоуронида, мг;

W – массовая доля воды в образце олигоуронида;

С – концентрация D-галактуроновой кислоты, установленная по калибровочному графику, мкМоль/л;

0,907 – коэффициент пересчета D-галактуроновой кислоты в ангидро-D-галактуроновую кислоту;

0,884 – коэффициент пересчета олигоуронида натрия в полигалактуроновую кислоту.

Массовую долю ангидро-D-галактуроной кислоты в образцах пектата кальция определяли фотометрическим методом для фракции менее 20 кДа и титриметрическим методом для остальных фракций. Титриметрический метод неприменим для низкомолекулярной фракции в связи с ее частичным растворением в спирте при переводе в кислую форму полигалактуронида и, как следствие, возникновению погрешности в анализе. По этой причине для анализа пектата с молекулярной массой 6,8 и 15,5 кДа применяли фотометрический метод, основанный на образовании мета-гидроксидифенилом окрашенного соединения с продуктами деградаций ангидро-D-галактуроной кислоты в серной кислоте. Определению предшествовало построение калибровочного графика, в качестве стандарта использовали D-галактуроновую кислоту. Массовую долю ангидро-D-галактуроновой кислоты (X1), в пересчете на сухое вещество, вычисляли по формуле:

(3)X1=m*0,907*100*100m1*(100-W), где

m – масса D-галактуроновой кислоты, установленная по калибровочному графику, мг;

m1 – масса исследуемого продукта, мг;

W – массовая доля воды в образце, %;

0,907 – коэффициент пересчета D-галактуроновой кислоты в ангидро-D- галактуроновую кислоту.

Титриметрический метод определения массовой доли ангидро-D-галактуроновой кислоты в пектине основан на титровании свободных и метоксилированных карбоксильных групп в остатках уроновых кислот 0,1 М раствором натрия гидроксида в присутствии индикатора Хинтона в среде 70% этилового спирта. Определению предшествовало промывание образца кислотным спиртовым раствором (5 см3 концентрированной соляной кислоты в 100см3 70%-го спирта).

Массовую долю ангидро-D-галактуроновой кислоты (Х2), в пересчете на сухое вещество, вычисляют по формуле:

(4) QUOTE X2=(0,0176V+0,0190V1)m1100100mm2(100-W) X2=(0,0176*V+0,0190*V1)*m1*100*100m*m2*(100-W), где

V – объем 0,1 М раствора гидроксида натрия, израсходованный на титрование свободных карбоксильных групп, см3;

V1 – объем 0,1М раствора гидроксида натрия, израсходованный на титрование метоксилированных карбоксильных групп, см3;

0,0176 – количество неметоксилированных остатков уроновых кислот, соответствующее 1 см3 0,1 М раствора натрия гидроксида, г;

0,0190 – количество метоксилированных остатков уроновых кислот, соответствующее 1см3 0,1 М раствора натрия гидроксида, г;

m – масса навески препарата до промывания, г;

m1 – масса навески препарата после промывания, г;

m2 – масса навески препарата, взятая для определения, г;

W – массовая доля влаги в препарате, %

Неводная алкалиметрия не подходила для определения альгиновых кислот в альгинате с молекулярной массой менее 20 кДа по тем же причинам, что и в случае с пектином. Поэтому массовую долю альгиновых кислот в низкомолекулярном образце устанавливали фотометрическим методом. В качестве стандарта для построения калибровочного графика использовали исходный альгинат натрия, в котором предварительно определяли массовую долю альгиновых кислот.

Массовую долю альгиновых кислот в продукте (Х3) в процентах, в пересчете на сухое вещество, вычисляли по формуле:

(5)X3=m*Xa*100m1*(100-W), где

m – масса альгината натрия, найденная по калибровочному графику, мг;

m1 – масса исследуемого продукта, мг;

Хa – массовая доля альгиновых кислот в альгинате натрия, %;

W – массовая доля воды в образце, %.

Определение массовой доли альгиновых кислот в образцах альгината с молекулярной массой 403,0 кДа проводили при помощи обратной алкалиметрии. Подготовленную пробу обрабатывали избытком 0,1 М раствора натрия гидроксида, выдерживали 1 ч. Затем остаток щелочи оттитровывали 0,05 М серной кислотой (индикатор – фенолфталеин).

Массовую долю альгиновых кислот (Х4) в процентах, в пересчете на сухое вещество, вычисляли по формуле:

(6)X4=V-V1*0,0176*100*100m*(100-W), где

QUOTE X4=V-V1*0,0176*100*100m*(100-W) V – объем раствора 0,1 М натрия гидроксида, добавленный в колбу, мл;

V1 – объем раствора 0,05 М серной кислоты, израсходованной на титрование избытка гидроксида натрия, мл;

m – масса альгината натрия, г;

W – массовая доля воды в альгинате натрия, %;

0,0176 – количество альгиновых кислот, эквивалентное 1 мл раствора 0,1 моль/л гидроксида натрия.

2.4. Определение констант связывания кадмия, свинца и ртути некрахмальными полисахаридами и препаратами сравнения in vitro

Для определения влияния молекулярной массы на кинетику взаимодействия пектинов и альгинатов с катионами тяжелых металлов и оптимального времени инкубирования проб, обеспечивающего полную сорбцию металлов исследуемыми образцами и препаратами сравнения, проводили эксперименты по изучению кинетики связывания металлов с сорбентами. С этой целью в емкость, снабженную магнитной мешалкой, помещали 0,25 г изучаемого сорбента, 10 мл буферного раствора для обеспечения необходимого рН, рассчитанный объем 0,1 М раствора исследуемого металла, эквивалентный количеству сорбента, и дистиллированную воду до 100 мл. Через установленные промежутки времени отбирали пробы по 10 мл, в которых после фильтрования определяли остаточное содержание металла. На основе полученных данных строили графики зависимости доли сорбированного металла в процентах от времени инкубации. За 100% принимали максимальное значение сорбционной емкости [Мыкоц Л.П. и др., 2010].

Оценку сорбционной активности образцов в отношении катионов свинца, кадмия и ртути проводили in vitro. Для этого в стакан, снабженный магнитной мешалкой, вносили рассчитанный объем 0,1 М раствора соли металла (Pb(NO3), Cd(NO3)2 или Hg(NO3)2), соответствующий его концентрации в растворе от 50 до 1200 мг/л, 1 мл 0,1 М ацетатного буфера со значением рН от 2,0 до 6,0 и 10 мл 0,25% суспензии исследуемого сорбента. По показаниям рН-метра корректировали значение рН среды добавлением 0,1 М раствора натрия гидроксида или азотной кислоты, после чего объем реакционной смеси доводили до 20 мл дистиллированной водой. Время инкубации при постоянном перемешивании составляло 60-120 мин при температуре 22-24С. После инкубации раствор со свободным металлом отделяли фильтрованием через гидрофильный фильтр Omnipore с диаметром пор 5,0 мкм. Определение остаточного содержания металла в жидкой фазе проводили комплексонометрически, и в качестве металлоиндикаторов использовали ксиленоловый оранжевый для кадмия и эриохром черный Т – для ртути и свинца.

Количество связавшегося с сорбентом металла вычисляли по формуле:

(7)q=V*(Ci-Ce)m, где

q – количество связавшегося с сорбентом металла, мг/г;

V – объем раствора в инкубационной емкости, л;

Ci – начальная концентрация металла в растворе (суспензии), мг/л;

Ce – равновесная концентрация в растворе (суспензии), мг/л;

m – масса экспериментального образца, г.

Изучение количественных параметров сорбции тяжелых металлов пектатами и альгинатами кальция различной молекулярной массы осуществляли с использованием математических моделей Лэнгмюра, Фрейндлиха и Брюне-Эммет-Теллера (БЭТ).

На основе экспериментальных данных строили изотермы сорбционного равновесия (поглощение металла полисахаридом против его остаточной концентрации). Коэффициент сродства экспериментальных препаратов к ионам металлов и их максимальную сорбционную емкость определяли с помощью сорбционной модели Лэнгмюра, описывающей процессы сорбции веществ на гомогенном монослое сорбента с конечным количеством активных центров связывания. Уравнение Лэнгмюра для сорбции из растворов имеет вид:

(8)q=qmax*Ceb+Ce, где

q – количество связавшегося с сорбентом металла, мг/г;

Ce – равновесная концентрация металла в растворе, мг/л;

b – коэффициент сродства экспериментального образца к металлу, л/мг;

qmax – максимальное связывание металла в данных условиях, мг/г полисахарида [Igwe J.C., Abia A.A., 2007].

Модель сорбции Фрейндлиха описывает сорбцию веществ на гетерогенном монослое сорбента с неопределенным количеством активных центров связывания. Данная модель позволяет оценить прочность и скорость образования химических связей между сорбентом и сорбатом. Ее особенностью является невозможность расчета количества активных центров на единице связывающего агента. Уравнение расчета модели Фрейндлиха выглядит следующим образом:

(9), где

qe – сорбционная емкость при данной равновесной концентрации, мг/г сухой массы сорбента;

Се – равновесная концентрация, мг/л;

КF – коэффициент Фрейндлиха, отражающий количество и прочность образующихся связей между сорбатом и сорбентом, мг/г;

n – коэффициент, отражающий интенсивность течения сорбционных процессов.

Модель сорбции БЭТ применяется для описания сорбционных процессов на гомогенной поверхности сорбента с ограниченным количеством активных центров при условии формирования многослойного связывания. Уравнение БЭТ выглядит следующим образом:

(10)q=qmaxKBET*Cf1+KBET-1*Cf(1-Cf), где

q – сорбционная емкость, мг/г;

qmax – максимальная сорбционная емкость, мг/г;

КBET – коэффициент отражающий энергию взаимодействия сорбата с поверхностью сорбента;

– остаточная концентрация металла в растворе [Khotimchenko M. et al., 2008а].

По результатам пяти экспериментов, рассчитывали константы Лэнгмюра, Фрейндлиха и БЭТ. Для оценки релевантности моделей использовали коэффициент аппроксимации (R2), в соответствии с которым для описания изученных процессов наиболее подходящими оказались модели Лэнгмюра и Фрейндлиха. Математическая модель БЭТ позволяла получить результаты с достоверностью менее 90% для описания связывания исследованных металлов полисахаридными препаратами и энтеросорбентами (R2<0,90).

2.5. Определение свинца в биологических образцах

Для определения содержания свинца в биологическом материале использовали атомно-абсорбционный метод [Никаноров А.М., Жулидов А.В., 1991]. Для этого образцы ткани высушивали до постоянной массы при температуре 85С. Навеску массой 0,2-0,5 г помещали в тефлоновый стакан, добавляли 10 мл смеси концентрированных кислот: 16 М HNO3 и 11,3 М HClO4 в объемном соотношении 3:1, оставляли на 24 ч при комнатной температуре, затем нагревали при 90С до полного растворения образца, упаривали до 1,5 мл, добавляли бидистиллированную воду, фильтровали через бумажный фильтр и объем доводили до 10 мл. Определение свинца проводили на атомно-абсорбционном спектрофотометре Shimadzu AA-6800. Предел обнаружения для растворов составлял 0,005 мкг/мл, для сухих веществ – 0,12 мкг/г [Sharma B., Tyagi S., 2013].

2.6. Характеристика экспериментальных животных

Экспериментальные исследования проводили на 33 половозрелых белых нелинейных крысах-самцах массой 130–160 г. Животных содержали в виварии ИБМ ДВО РАН. Во время экспериментальных исследований крыс помещали в специальные пластмассовые клетки со стружечной подстилкой по 4-5 животных в каждой. Все животные помимо сбалансированного рациона (корм для лабораторных крыс и мышей «ПроКорм», соответствующий ГОСТ Р 50258-92) получали овес, хлеб, свежие овощи и фрукты, мел и комплексные поливитаминные препараты.

Основные требования к содержанию, выбору и подготовке животных для экспериментов осуществляли в соответствии с принятыми рекомендациями. При разделении животных на группы проводили их ранжирование по массе тела с целью обеспечения сопоставимости указанных групп по данному показателю. Содержание животных, наркоз, декапитацию проводили в соответствии с рекомендациями Рабочей группы Федерации Европейского Сообщества по науке лабораторных животных [Копаладзе Р.Е., 1998].

Исследование одобрено на заседании этического комитета Государственного бюджетное общеобразовательного учреждения высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Протокол № 5, дело № 32 от 19 апреля 2010 г.).

2.7. Статистическая обработка результатов

Для статистического анализа и обработки результатов исследования рассчитывали средние арифметические величины и ошибки средних арифметических. Оценку достоверности различия результатов экспериментальных наблюдений проводили в сравнении с контролем с применением t-критерия Стьюдента для малых величин (n <30).

Для оценки результатов исследований с несколькими выборками использовали метод однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим проведением post hoc теста Tkuey’s. Уровень значимости считали достоверным при p <0,05.

Статистическую обработку полученных в ходе исследований результатов проводили с использованием программного обеспечения SPSS for Windows, версия 11.0.

Глава 3

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ НЕКРАХМАЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ

3.1. Получение пектинов

На основании литературных данных нами был разработан авторский метод ступенчатого кислотного гидролиза пектина 0,5 М соляной кислотой. Применение в качестве гидролизующего агента соляной кислоты является экономически выгодным. Предложенные нами условия позволяют сократить время гидролиза по сравнению с существующими запатентованными методиками, и получить олигомеры с молекулярными массами 1-10 кДа и 10-20 кДа. Ступенчатый гидролиз увеличивает выход готового продукта и предотвращает деградацию олигоуронидов за счет снижения времени их контакта с гидролизующим агентом.

В работе использовали пектат кальция с молекулярной массой 48,6 кДа (образец № 1) и два олигоуронида (образцы № 2 и №3), полученные путем ступенчатого кислотного гидролиза.

Образец №1 был получен из исходного высокоэтерифицированного цитрусового пектина путем его щелочной деэтерификации в среде 70% этанола. После нейтрализации среды концентрированной соляной кислотой, пектин переводили в кальциевую соль добавлением эквивалентного количества 1 М раствора кальция хлорида. Полученный осадок пектата кальция отделяли фильтрованием, промывали 70% этанолом и сушили при 80°С.

Образцы №2 и №3 пектата кальция были получены из низкоэтерифицированного пектина с молекулярной массой 48,6 кДа путем поэтапного кислотного гидролиза его 5% суспензии 0,5 М соляной кислотой при постоянной температуре 90±0,5°С. Перед проведением гидролиза пектат натрия переводили в пектовую кислоту путем реакции ионного обмена с 1 М раствором соляной кислоты, в результате которой образовывался осадок. Первый этап гидролиза проводили в течение 2 ч для удаления нейтральных моносахаридов. С этой целью осадок пектовой кислоты суспендировали в 10-кратном избытке 0,5 М раствора соляной кислоты при температуре 90±0,5°С и интенсивном перемешивании [Khotimchenko M. et al., 2012]. Оставшийся осадок пектина, состоящий в основном из полигалактуроновой кислоты, промывали 0,5 М соляной кислотой для удаления остатка нейтральных моносахаридов и подвергали дальнейшему гидролизу в течении еще 2 ч при вышеописанных условиях. По окончании гидролиза смесь охлаждали, и отделяли жидкую фазу от нерастворимого осадка пектина центрифугированием при 2000g 30 минут.

Для получения образца № 2 осадок пектина переводили в раствор путем нейтрализации 1 М раствором аммония гидроксида до рН 4-5 и очищали на ультрафильтрационной мембране Millipore из регенерированной целлюлозы с пределом пропускания 30 кДа при давлении 0,3 МПа до конечного объема раствора в ультрафильтрационной ячейке, соответствующего 15-20% первоначального объема. Затем объем раствора ячейки доводили до первоначальной величины добавлением 0,005 М раствора ЭДТА с рН 4-5, и процесс фильтрации повторяли. Данную процедуру повторяли еще раз, проводя 3 цикла фильтрации. Затем полученный фильтрат пропускали через ультрафильтрационную мембрану 10 кДа по методике, приведенной выше для удаления низкомолекулярных олигосахаридов. Из раствора, не прошедшего через мембрану, осаждали пектат кальция добавлением 1 М раствора кальция хлорида. Осадок отделяли центрифугированием, промывали 70% этанолом и сушили при 80°С.

Образец № 3 получали из жидкой фазы гидролизатов. Для этого жидкую фазу нейтрализовали 1 М гидроксидом аммония до рН 4-5 и подвергали последовательному фракционированию на ультрафильтрационных мембранах Millipore с пределами пропускания 10 и 3 кДа. Фракцию, прошедшую через мембрану 10 кДа и задержанную на мембране 3 кДа, обрабатывали 1 М хлоридом кальция и выделяли пектат кальция описанным выше способом. Химические реакции, протекающие в ходе гидролиза, можно представить в виде схемы (Рисунок 5).

Рисунок 5. Ступенчатый кислотный гидролиз пектина.

В полученных образцах пектата кальция определяли содержание ангидрогалактуроновой кислоты по реакции с м-гидроксидифенилом, а количественное содержание кальция – комплексонометрическим методом. Молекулярную массу образца № 1 оценивали визкозиметрическим методом, образцов № 2 и № 3 – методом эксклюзионной ВЭЖХ на колонке Shodex-AsahipakGS-320 7E [Макарова К.Е. и др., 2013].

3.2. Получение альгинатов

Образцы альгината кальция получали из коммерческого альгината натрия по методике, аналогичной получению пектата кальция. Перед проведением гидролиза альгинат натрия предварительно переводили в кислотную форму путем реакции ионного обмена с 1 М раствором соляной кислоты. Полученную альгиновую кислоту суспендировали в 10-кратном избытке 0,5 М раствора соляной кислоты при температуре 90±0,5°С и интенсивном перемешивании в течение 2 ч для удаления гетерогенных (нерегулярных) участков молекул. По окончании гидролиза смесь охлаждали и отделяли жидкую фазу от нерастворимого осадка альгиновой кислоты центрифугированием при 2000g 30 мин. Полученный осадок промывали путем суспендирования в 5-кратном объеме 0,5 М раствора соляной кислоты и отделяли центрифугированием при описанных выше условиях.

Для получения образца № 2, осадок альгиновой кислоты подвергали повторному двухчасовому гидролизу по вышеописанной методике. Затем жидкую фазу отделяли центрифугированием. Полученный осадок переводили в раствор путем нейтрализации 1 М раствором аммония гидроксида до рН 4-5, пробу разводили до конечной концентрации олигоуронидов 1-2 мг/мл, и добавляли натриевую соль ЭДТА до концентрации 0,005 М, пропускали через ультрафильтрационную мембрану Millipore из регенерированной целлюлозы с пределом пропускания 30 кДа при стабилизированном давлении 0,3 МПа. После чего объем раствора доводили до первоначальной величины добавлением 0,005 М раствора ЭДТА с рН 4-5, и процесс фильтрации повторяли. Данную процедуру проводили трижды, полученный фильтрат очищали от низкомолекулярных фракций на ультрафильтрационной мембране с размером пор 10 кДа по вышеприведенной методике.

Образец №3 получали из жидкой фазы гидролизата, полученного после двухчасового гидролиза образца №2. Жидкую фазу предварительно нейтрализовали раствором 1 М гидроксида аммония до рН 4-5 и подвергали последовательному фракционированию на ультрафильтрационных мембранах с пределами пропускания 10 кДа и 3 кДа. Для этого использовали следующую методику: жидкую фазу пропускали через мембрану при стабилизированном давлении 0,3 МПа до конечного объема раствора в ультрафильтрационной ячейке, соответствующего 15-20% первоначального объема, затем объем раствора ячейки доводили до первоначального 0,005 М раствора ЭДТА с рН 4-5 и процесс фильтрации повторяли. Данную процедуру проводили трижды (Рисунок 6).

Рисунок 6. Ступенчатый кислотный гидролиз альгината.

Полученные образцы переводили в кальциевую форму добавлением 1 М раствора кальция хлорида по методике аналогичной получению пектатов кальция, высушивали при 80°С и характеризовали по молекулярной массе. Методом эксклюзионной ВЭЖХ на колонке Shodex Asahipak GS-320 7E было установлено следующее молекулярно-массовое распределение: образец №3 – 4-11 кДа, образец № 2 – 11-21 кДа. Для образца №1 данная характеристика была определена методом вискозиметрии и составила – 403,0 кДа (Таблица 1)

Таблица 1

Физико-химические характеристики экспериментальных образцов некрахмальных полисахаридов

Наименование образца № образца Наименование показателя

Молекулярная масса, кДа Массовая доля уроновых кислот, % Содержание кальция, %

Средневесовая Среднечисленная Молекулярно-массовое распределение Пектат кальция 1 48,6 – – 69,0 7,9

2 15,5 11,8 12-20 85,2 8,3

3 6,8 6,7 5-10 84,9 8,5

Альгинат кальция 1 403,0 – – 77,3 7,25

2 18,0 14,1 11-21 86,2 7,53

3 8,1 5,5 4-11 85,9 7,98

Примечание. Символ «–» в ячейках указывает на то, что значение не определяли.

Глава 4

ИЗУЧЕНИЕ ЗАВИСИМОСТИ МЕТАЛЛСВЯЗЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ПЕКТИНОВ И АЛЬГИНАТОВ ОТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ

4.1. Свинецсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой in vitro

4.1.1. Кинетика связывания свинца пектинами и альгинатами с различной молекулярной массой и препаратами сравнения

Изучению свинец-связывающей активности некрахмальных полисахаридов, олигоуронидов и препаратов сравнения предшествовали выявление влияния молекулярной массы образцов на кинетику их взаимодействия с катионами металла и выбор оптимального времени инкубации (глава 2.2). Для этого максимальную сорбционную емкость каждого образца в отношении катионов свинца, полученную в ходе соответствующего эксперимента, принимали за 100%, а количество металла, связанного сорбентом за 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 и 120 мин выражали в процентах от максимального значения. Результаты представляли в виде графиков.

На первом этапе взаимодействия, в течение первых 20 мин, концентрация металла в растворе снижалась резко, насыщение сорбента катионами составляло около 90%. Полное равновесие устанавливалось на 60-ой минуте взаимодействия. Дальнейшая инкубация не приводила к изменению остаточной концентрации катионов, что обусловило выбор оптимального времени взаимодействия образцов пектатов и альгинатов с катионами свинца (Рисунки 8, 9). Таким образом, кинетика взаимодействия некрахмальных полисахаридов с катионами свинца не зависела от молекулярной массы пектата кальция и альгината кальция.

Рисунок 7. Кинетика связывания свинца пектатами кальция с различной молекулярной массой.

На рисунках 7-9 по оси абсцисс – время взаимодействия, мин; по оси ординат – количество связанного свинца, % от максимальной сорбционной емкости каждого пектата.

Рисунок 8. Кинетика связывания свинца альгинатами кальция с различной молекулярной массой.

Препараты сравнения сорбировали свинец из раствора значительно медленнее. За первые 20 минут эксперимента данный показатель достигал около 70% от максимального значения, к 60-й минуте – около 90%, и сорбционное равновесие в растворе устанавливалось через 120 минут (Рисунок 9).

Рисунок 9. Кинетика связывания свинца препаратами сравнения.

4.1.2. Свинецсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой и препаратов сравнения при рН 2,0-6,0

Исследовали сорбционные характеристики образцов пектатов кальция, альгинатов кальция и препаратов сравнения в отношении катионов свинца в диапазоне рН от 2,0 до 6,0. Для поддержания требуемого значения рН во время эксперимента использовали: глицериновый буфер (глицерин / HNO3) для рН 2,0 и ацетатный (уксусная кислота / NaOH) для рН 4,0 и 6,0.

Количественно данные по связыванию катионов свинца исследуемыми образцами использовали для построения изотерм сорбции на графиках по оси ординат откладывали сорбцию свинца, а по оси абсцисс – остаточную концентрацию металла. Форма полученных кривых соответствовала изотермам Лэнгмюра. Определение количественных параметров сорбции осуществляли с использованием математических моделей Лэнгмюра, Фрейндлиха и Брюне-Эммет-Теллера (БЭТ).

Для подтверждения релевантности методов использовали коэффициенты достоверности аппроксимации. Их значения для математической модели БЭТ были значительно ниже 0,90, что указывало на невозможность дальнейшего использования данной математической модели. Для математической модели Лэнгмюра коэффициент аппроксимации R2>0,95, следовательно, данную модель можно использовать для установления коэффициентов сродства экспериментальных образцов к катионам свинца и показателей максимальной сорбционной емкости сорбентов. Коэффициент аппроксимации для модели Фрейндлиха был ниже, чем для модели Лэнгмюра (R2>0,90), но данная величина позволяла использовать его для характеристики сорбционного взаимодействия между исследуемыми сорбентом и сорбатом.

При изучении влияния рН на сорбционную емкость пектатов и альгинатов кальция различной молекулярной массы была выявлена общая закономерность: увеличение показателя максимальной сорбции с ростом рН от 2,0 до 6,0 (Таблицы 2-3). Данный диапазон рН охватывал рН желудка (1,5-2,0) и частично кишечника (5,6–7,9) здорового человека. При дальнейшем увеличении рН происходило образование гидроксида свинца, нерастворимого в воде, что значительно затрудняло течение сорбционных процессов. При рН ниже 2,0 все некрахмальные полисахариды вне зависимости от молекулярной массы седиментировались и теряли сорбционную активность, что делало нецелесообразным проведение опытов при данных значениях рН.

Таблица 2

Экспериментальные константы связывания свинца пектатами кальция с различной молекулярной массой и препаратами сравнения при рН 2,0-6,0

Экспериментальные образцы рН Модель Лэнгмюра Модель Фрейндлиха

qmax, максимальная связывающая емкость, мг/г b, константа сродства, л/мг R2, коэффициент достоверности аппроксимации KF, коэффициент связыва

ющей емкости n, коэффициент интенсивно

сти сорбции R2, коэффициент достоверности аппроксимации

Пектат кальция

48,6 кДа 2,0 96,51±24,44 0,057±0,039 0,988 36,89±21,34 6,69±2,54 0,900

4,0 572,56±16,62 0,0060±0,00064 0,986 61,42±15,55 2,90±0,38 0,965

6,0 493,57±16,62 0,0060±0,00064 0,992 8,68±0,89 1,62±0,052 0,974

Пектат кальция

15,5 кДа 2,0 241,10±10,98 0,0084±0,0017 0,982 22,77±5,53 2,97±0,35 0,975

4,0 572,56±16,62 0,0060±0,00064 0,986 61,42±15,55 2,90±0,38 0,965

6,0 602,98±5,89 0,015±0,0028 0,991 75,58±12,68 2,99±0,28 0,956

Пектат кальция

6,8 кДа 2,0 261,00±12,49 0,0077±0,0018 0,983 17,03±4,49 2,53±0,27 0,973

4,0 598,04±31,96 0,010±0,0027 0,972 36,15±2,77 2,30±0,067 0,931

6,0 663,54±10,57 0,010±0,00064 0,978 37,68±3,04 2,22±0,070 0,901

Активированный уголь 2,0 20,85±9,49 0,0003±0,015 0,959 3,32±0,89 4,83±0,72 0,911

4,0 99,63±13,69 0,0044±0,0017 0,960 2,41±0,89 1,89±0,22 0,970

6,0 135,99±14,08 0,0082±0,00034 0,957 13,24±5,44 3,08±0,67 0,911

Полифепан 2,0 25,05±6,54 0,0078±0,007 0,954 12,18±2,24 1,25±0,45 0,902

4,0 112,06±5,34 0,017±0,0031 0,986 14,45±1,53 3,28±0,21 0,930

6,0 128,75±10,04 0,012±0,0044 0,954 12,03±2,43 2,86±0,30 0,901

Микрокристаллическая целлюлоза 2,0 26,55±6,73 0,010±0,0010 0,951 2,99±0,39 3,44±0,52 0,908

4,0 28,40±4,44 0,0058±0,0037 0,972 1,53±0,31 2,46±0,20 0,906

6,0 27,79±2,46 0,25±0,061 0,984 11,30±2,38 8,84±0,54 0,919

Таблица 3

Экспериментальные константы связывания свинца альгинатами кальция с различной молекулярной массой и препаратами сравнения при рН 2,0-6,0

Экспериментальные образцы рН Модель Лэнгмюра Модель Фрейндлиха

qmax, максимальная связывающая емкость, мг/г b, константа сродства, л/мг R2, коэффициент достоверности аппроксимации KF, коэффициент связываю

щей емкости n, коэффициент интенсивности сорбции R2, коэффициент достоверности аппроксимации

Альгинат кальция

403 кДа 2,0 158,15±7,41 0,0031±0,0002 0,952 1,99±0,34 1,62±0,081 0,902

4,0 563,47±6,40 0,12±0,010 0,999 245,83±47,78 6,66±1,45 0,909

6,0 612,64±7,70 0,099±0,0081 0,999 213,81±63,37 5,21±1,70 0,909

Альгинат кальция

18,0 кДа 2,0 161,30±8,91 0,010±0,0030 0,976 19,51±4,61 3,28±0,41 0,971

4,0 583,17±25,95 0,020±0,0044 0,983 19,51±4,61 3,28±0,41 0,971

6,0 649,30±25,04 0,016±0,0031 0,995 53,39±12,59 2,39±0,28 0,962

Альгинат кальция

8,1 кДа 2,0 177,10±14,54 0,0098±0,0037 0,974 23,48±6,06 3,52±0,54 0,968

4,0 664,07±28,42 0,027±0,0069 0,995 99,47±27,72 3,15±0,54 0,901

6,0 732,56±22,23 0,029±0,0051 0,990 105,33±47,80 3,00±0,85 0,904

Активированный уголь 2,0 20,85±9,49 0,0003±0,015 0,959 3,32±0,89 4,83±0,72 0,911

4,0 99,63±13,69 0,0044±0,0017 0,960 2,41±0,89 1,89±0,22 0,970

6,0 135,99±14,08 0,0082±0,00034 0,957 13,24±5,44 3,08±0,67 0,911

Полифепан 2,0 25,05±6,54 0,0078±0,007 0,954 12,18±2,24 1,25±0,45 0,902

4,0 112,06±5,34 0,017±0,0031 0,986 14,45±1,53 3,28±0,21 0,930

6,0 128,75±10,04 0,012±0,0044 0,954 12,03±2,43 2,86±0,30 0,901

Микрокристаллическая целлюлоза 2,0 26,55±6,73 0,010±0,0010 0,951 2,99±0,39 3,44±0,52 0,908

4,0 28,40±4,44 0,0058±0,0037 0,972 1,53±0,31 2,46±0,20 0,906

6,0 27,79±2,46 0,25±0,061 0,984 11,30±2,38 8,84±0,54 0,919

Эксперименты показали, что снижение молекулярной массы некрахмальных полисахаридов приводило к увеличению максимальной сорбционной емкости для всех значений рН (Рисунки 10-18). Данный показатель для пектата кальция 6,8 кДа при рН 2,0 превосходил таковой для пектина 48,6 кДа и 15,5 кДа в среднем в 2,7 и в 1,1, при рН 4,0 в среднем в 1,4 и в 1,1 раза, при рН 6,0 в среднем в 1,3 и в 1,1 раза, соответственно (Таблицы 2-3).

Максимальная сорбционная емкость альгината кальция 8,1 кДа при рН 6,0 была наибольшей среди трех образцов альгинатов кальция и превосходила в среднем в 1,2 и в 1,1 раза образцы альгината кальция 403 кДа и 18,0 кДа соответственно, при рН 4,0 в среднем в 1,2 и в 1,1 раза, при рН 2,0 – в среднем в 1,1 и 1,1 раза, соответственно (Таблицы 2-3).

Сравнительная оценка экспериментальных констант всех исследованных образцов показала, что наибольшей связывающей активностью в отношении катионов свинца при рН 2,0 обладал пектат кальция 6,8 кДа. Его максимальная сорбционная емкость превосходила таковую для альгината кальция 8,1 кДа, активированного угля, полифепана и микрокристаллической целлюлозы в среднем в 1,5, 12,5, 10,4, 9,8 раза, соответственно (Таблицы 2-3).

При рН 4,0 максимальная сорбционная емкость альгината кальция 8,1 кДа была наибольшей и превышала этот показатель для пектата кальция 6,8 кДа, активированного угля, полифепана и микрокристаллической целлюлозы в среднем в 1,1, 6,7, 5,9, 23,4 раза, соответственно. При значении рН 6,0 указанная закономерность сохранялась, показатель максимальной сорбционной емкости альгината кальция превосходил этот параметр для о пектата кальция 6,8 кДа, активированного угля, полифепана, микрокристаллической целлюлозы в среднем в 1,10; 5,39; 5,69 и 26,36 раза соответственно (Таблицы 2-3).

На рисунках 10-18 q – количество свинца, связавшегося с образцом, мг/г; Ce – равновесная концентрация свинца в растворе, мг/л.

Сравнение экспериментальных констант Фрейндлиха и Лэнгмюра для образцов, обладающих максимальной сорбционной активностью в отношении катионов свинца, показало, что константы сродства, коэффициенты аффинитета и интенсивности сорбции для альгината кальция 8,1 кДа превосходят аналогичные экспериментальные константы пектата кальция 6,8 кДа (Таблицы 2-3).

4.2. Кадмийсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой in vitro

4.2.1. Кинетика связывания кадмия с пектинами и альгинатами с различной молекулярной массой

Методика определения кинетики связывания катионов кадмия была аналогична таковой для катионов свинца (глава 2.2). В первые 5 минут эксперимента образцы альгината кальция сорбировали около 80% металла. Для пектина этот показатель был несколько выше и в среднем составляло 88%. В дальнейшем процесс сорбции резко замедлялся, и полное сорбционное равновесие для исследованных полисахаридов достигалось через 60 мин.

Снижение молекулярной массы пектатов кальция и альгинатов кальция приводило к незначительному увеличению доли связанного металла в единицу времени, равновесие в пробах достигалось не ранее 60 минут.

Полифепан и микрокристаллическая целлюлоза не проявляли кадмий-связывающей активности при рН 2,0, 4,0 и 6,0, поэтому кривые сорбции для них не были построены. Активированный уголь при рН 6,0 незначительно связывал ионы кадмия.

Исходя из полученных данных, снижение молекулярной массы не влияло на кинетику взаимодействия образцов пектат и альгината кальция с катионами кадмия. Время инкубации для всех образцов некрахмальных полисахаридов составило 60 мин (Рисунки 19, 20), дальнейшие исследования с препаратами сравнения по связыванию ионов кадмия не проводили.

4.2.2. Кадмийсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой при рН 2,0-6,0

Исследования сорбционных свойств образцов альгинатов кальция с молекулярной массой 403,0, 18,0 и 8,1 кДа и пектатов кальция с молекулярной массой 48,6, 15,5 и 6,8 кДа в отношении катионов кадмия проводили по методике, аналогичной изучению свинецсвязывающей активности данных веществ (глава 3.1.2).

Рисунок 19. Кинетика связывания кадмия пектатами с различной молекулярной массой.

На рисунке 19-20 по оси абсцисс – время взаимодействия, мин; по оси ординат – количество связанного кадмия, % от максимальной сорбционной емкости.

Рисунок 20. Кинетика связывания кадмия альгинатами кальция с различной молекулярной массой.

В ходе экспериментов были установлены параметры сорбционной активности пектатов кальция и альгинатов кальция с различной молекулярной массой в отношении катионов кадмия при рН 2,0-6,0. Дальнейшее увеличение рН раствора приводило к образованию гидроксида кадмия, который является малорастворимым соединением, что делало невозможным проведение исследования. При рН ниже 2,0 все некрахмальные полисахариды вне зависимости от молекулярной массы седиментировались и теряли сорбционную активность.

Максимальная сорбционная емкость пектата кальция 6,8 кДа превышала таковую для образцов с молекулярной массой 15,5 и 48,6 кДа в среднем в 1,2 и 1,8 раза при рН 6,0, при рН 4,0 – в среднем в 1,4 и 3,3 раза, а при рН 2,0 – в среднем в 1,1 и 1,6 раза, соответственно (Таблицы 4-5).

Значение максимальной сорбционной емкости альгината кальция 8,1 кДа так же выше аналогичной величины для образцов с молекулярной массой 18,0 и 403,0 кДа при рН 6,0 в среднем в 1,3 и 2,1 раза, при рН 4,0 – в среднем в 1,3 и 1,8 раза; при рН 2,0 – в среднем в 1,3 и 2,4 раза, соответственно (Таблицы 4-5).

Увеличение рН приводило к росту максимальной сорбционной емкости образцов вне зависимости от молекулярной массы, для пектата кальция 6,8 кДа ее значение при рН 6,0 в среднем в 1,2 и 2,9 раза превосходили этот показатель при рН 4,0 и 2,0, для пектата кальция 15,5 кДа – в среднем в 1,5 и 2,8 раза, для пектата кальция 48,6 кДа– в среднем в 2,2 и 2,5 раза, соответственно (Рисунки 21-23).

Таблица 4

Экспериментальные константы связывания кадмия пектатами кальция с различной молекулярной массой и активированным углем при рН 2,0-6,0

Экспериментальные образцы рН Модель Лэнгмюра Модель Фрейндлиха

qmax, максимальная связывающая емкость, мг/г b, константа сродства, л/мг R2, коэффициент достоверно

сти аппрокси

мации KF, коэффициент связываю

щей емкости n, коэффициент интенсивно

сти сорбции R2, коэффициент достоверности аппроксимации

Пектат кальция

48,6 кДа 2,0 71,65±3,91 0,0039±0,00035 0,984 1,59±0,21 1,86±0,085 0,946

4,0 81,32±5,36 0,0028±0,00033 0,935 0,88±0,14 1,58±0,073 0,933

6,0 181,77±8,71 0,0042±0,00046 0,969 3,28±0,51 1,73±0,080 0,970

Пектат кальция

15,5 кДа 2,0 99,65±4,92 0,0064±0,0011 0,961 5,80±0,87 2,49±0,16 0,941

4,0 186,87±10,04 0,0022±0,0021 0,956 1,23±0,14 1,43±0,040 0,961

6,0 274,37±22,65 0,0035±0,00060 0,969 2,73±0,44 1,49±0,067 0,952

Пектат кальция

6,8 кДа 2,0 112,69±6,15 0,0093±0,0021 0,979 8,24±1,12 2,63±0,17 0,978

4,0 269,35±13,71 0,0081±0,0020 0,987 11,69±2,02 2,04±0,075 0,959

6,0 324,84±16,07 0,0089±0,0044 0,984 13,75±3,47 2,03±0,18 0,970

Активированный уголь 2,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

4,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

6,0 19,03±5,27 0,0036±0,00039 0,971 0,26±0,10 1,67±0,38 0,907

Полифепан 2,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

4,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

6,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

Микрокристаллическая целлюлоза 2,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

4,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

6,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

Таблица 5

Экспериментальные константы связывания кадмия альгинатами кальция с различной молекулярной массой и активированным углем при рН 2,0-6,0

Экспериментальные образцы рН Модель Лэнгмюра Модель Фрейндлиха

qmax, максимальная связывающая емкость, мг/г b, константа сродства, л/мг R2, коэффициент достоверно

сти аппрокси

мации KF, коэффициент связываю

щей емкости n, коэффициент интенсивно

сти сорбции R2, коэффициент достоверности аппроксимации

Альгинат кальция 403,0 кДа 2,0 70,21±8,34 0,0044±0,0019 0,962 1,80±0,86 1,93±0,27 0,967

4,0 135,31±6,23 0,0029±0,00027 0,974 1,50±0,17 1,58±0,048 0,960

6,0 177,75±10,71 0,0046±0,00073 0,985 3,55±0,56 1,77±0,083 0,972

Альгинат кальция 18,0 кДа 2,0 122,99±9,30 0,0054±0,0015 0,984 3,50±1,09 1,94±0,19 0,975

4,0 186,87±10,04 0,0023±0,0021 0,951 1,23±0,14 1,43±0,040 0,961

6,0 279,98±18,11 0,0034±0,00050 0,979 2,69±0,43 1,48±0,059 0,960

Альгинат кальция

8,1 кДа 2,0 164,78±6,12 0,013±0,0023 0,987 13,87±1,69 2,70±0,16 0,976

4,0 237,30±7,41 0,0091±0,0021 0,993 16,49±3,28 2,51±0,14 0,932

6,0 374,07±16,18 0,018±0,0038 0,991 32,52±9,19 2,56±0,34 0,945

Активированный уголь 2,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

4,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

6,0 19,03±5,27 19,03±5,27 19,03±5,27 19,03±5,27 19,03±5,27 19,03±5,27

Полифепан 2,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

4,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

6,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

Микрокристаллическая целлюлоза 2,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

4,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

6,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

На рисунках 21-26 q – количество кадмия, связавшегося с образцом некрахмального полисахарида, мг/г;

Ce – равновесная концентрация кадмия в растворе, мг/л.

Аналогичным образом увеличение рН среды сказывалось на всех параметрах связывания альгинатов кальция. Максимальная сорбционная емкость образца 8,1 кДа при рН 6,0 превосходила данный показатель при рН 4,0 в среднем в 1,58 раза и в среднем в 2,2 раза при рН 2,0. Для альгината кальция 18,0 кДа сохранялась та же закономерность. Значение этого показателя при рН 6,0 больше, чем при рН 4,0 в среднем в 1,5 и в 2,3 раза больше, чем при рН 2,0. Для образца 403,0 кДа разница была в среднем в 1,3 и 2,5 раза больше при рН 4,0 и 2,0, соответственно (Рисунки 24-26).

Среди исследованных образцов полисахаридов максимальной сорбционной емкостью в отношении катионов кадмия обладали образцы альгината кальция 8,1 кДа и пектата кальция 6,8 кДа. При рН 2,0 значение qmax для альгината кальция превосходили аналогичное значение пектата кальция в среднем в 1,5 раза. При рН 4,0-6,0 величины максимальной сорбционной емкости для данных препаратов не различались более чем в 1,15 раза.

Сравнение остальных экспериментальных констант Фрейндлиха и Лэнгмюра для образцов, обладающих максимальной сорбционной активностью в отношении катионов кадмия, показало, что константа сродства, коэффициенты связывающей емкости и интенсивности сорбции альгината кальция 8,1 кДа достоверно превосходили аналогичные параметры пектата кальция 6, 8 кДа.

4.3. Ртутьсвязывающая активность пектинов и альгинатов с различной молекулярной массой in vitro

4.3.1. Кинетика связывания ртути с пектинами и альгинатами с различной молекулярной массой и активированным углем

В ходе исследования кинетики сорбции способность связывать катионы ртути была выявлена у всех некрахмальных полисахаридов. Среди препаратов сравнения данным свойством обладал только активированный уголь, поэтому графики зависимости доли связанного металла от времени инкубации были построены только для этих сорбентов. Дальнейшие эксперименты с микрокристаллической целлюлозой и полифепаном не проводили, изотермы сорбции построены не были, параметры сорбции не рассчитывались.

Полученные для некрахмальных полисахаридов кривые свидетельствовали о незначительной зависимости кинетики процесса от молекулярной массы сорбента (Рисунки 27,28).

На кривых, отображающих связывание катионов ртути альгинатами кальция с молекулярной массой 403,0, 18,0 и 8,1 кДа показано, что в первые 5 мин образцы сорбировали в среднем 75% от максимально возможного количества металла, к 40-й мин этот показатель достигал 95%. Пектаты кальция в тех же условиях сорбировал ртуть быстрее; за первые 5 мин связывалось около 80%, к 20-й минуте доля связанного металла от максимальной сорбционной емкости превышала 90%, полное равновесие наступило к 40-й минуте.

Исследования кинетики сорбционного процесса позволило определить оптимальное время инкубации; для альгинатов кальция и активированного угля оно составило 60 мин, для образцов пектатов 40 мин (Рисунки 27-29).

Рисунок 27. Кинетика связывания ртути пектатами кальция с различной молекулярной массой.

На рисунках 27-29 по оси абсцисс – время взаимодействия, мин; по оси ординат – количество связанной ртути, % от максимальной сорбционной емкости образца.

Рисунок 28. Кинетика связывания ртути альгинатами кальция с различной молекулярной массой.

Рисунок 29. Кинетика связывания ртути препаратами сравнения.

4.3.2. Ртутьсвязывающая активность пектатов и альгинатов с различной молекулярной массой и активированного угля

при рН 2,0-6,0

Эксперименты по изучению сорбционной активности некрахмальных полисахаридов и активированного угля поводили по методике, описанной в главе 3.3.1. Опыты проходили при рН 2,0-6,0, дальнейшее повышение рН среды приводило к образованию гидроксида ртути, который в растворе распадался до нерастворимого в воде соединения, что делало невозможным дальнейшее изучение процесса сорбции. При рН среды ниже 2,0 все полисахариды вне зависимости от молекулярной массы седиментировались и теряли сорбционную активность.

Наибольшей сорбционной активностью в отношении катионов ртути обладал пектат кальция 6,8 кДа при рН 6,0. Данный показатель для образца 15,5 кДа был ниже в среднем в 1,2 раза, для образца 48,6 кДа – в среднем в 1,2 раза. Этот же показатель для альгината кальция 8,1 кДа так же превосходил показатель сорбции образца 18,0 кДа в среднем в 1,4 раза, образца 403,0 кДа – в среднем в 1,6 раза (Рисунки 30-35).

С ростом рН от 2,0 до 6,0 происходило увеличение максимальной сорбционной емкости у всех исследованных образцов. Ее значение для пектата кальция 6,8 кДа при рН 6,0 превосходило аналогичный показатель при рН 4,0 в среднем в 1,3 раза, при рН 2,0 – в среднем в 2,7 раза, для образца 15,5 кДа в среднем – в 1,3 и 2,3 раза, для образца 48,6 кДа – в среднем в 1,6 и 2,3 раза, соответственно.

На рисунках 30-36 q – количество ртути, связавшейся с образцом, мг/г; Ce – равновесная концентрация ртути в растворе, мг/л.

Ртутьсвязывающая активность альгината кальция 8,1 кДа при рН 6,0 была выше, чем при рН 4,0 в среднем в 1,6 раза, и чем при рН 2,0 в среднем в 3,0. Для образца альгината кальция 18,0 кДа сохранялась та же закономерность. Максимальная сорбционная емкость при рН 6,0 была выше в среднем в 1,58, чем при рН 4,0 и в среднем в 2,4 раза выше, чем при рН 2,0. Образец альгината кальция 403 кДа при рН 6,0 связывал ртути в среднем в 1,5 больше, чем при рН 4,0 и 3,3 раза больше, чем при рН 2,0, соответственно.

Максимальную сорбционную емкость в отношении катионов ртути при рН 2,0-6,0 наблюдали у пектата кальция 6,8 кДа, которая превосходила данную константу для альгината кальция 8,1 кДа при рН 2,0 в среднем в 1,7 раза, при рН 4,0 – в среднем в 1,6 раза, при рН 6,0 – в среднем в 1,3 раза (Таблицы 6-7). Для остальных констант сорбции четкой закономерности не было выявлено. Для пектата кальция 6,8 кДа при рН 2,0-4,0 константа сродства к катионам ртути была выше, а при рН 6,0 ниже, чем для альгината кальция 8,1 кДа. Коэффициент Фрейндлиха при рН 2,0-4,0 у пектата кальция 6,8 кДа был выше, а коэффициент интенсивности сорбции – ниже, чем у альгината кальция 8,1 кДа. При рН 6,0 обе константы Фрейндлиха пектата кальция 6,8 кДа превосходили аналогичные параметры альгината кальция (Таблицы 6-7).

Образцы некрахмальных полисахаридов вне зависимости от молекулярной массы превосходили по ртуть-связывающей активности активированный уголь при рН 6,0 (Рисунок 36). Максимальная сорбционная емкость пектата кальция 6,8 кДа в отношении катионов ртути достоверно выше, чем для активированного угля в среднем в 3,9 раза. Значение максимальной сорбционной емкости альгината кальция 8,1 кДа для катионов ртути превышает этот показатель у активированного угля, в среднем в 3,0 раза.

Таблица 6

Экспериментальные константы связывания ртути пектатами кальция с различной молекулярной массой и активированным углем при рН 2,0-6,0

Экспериментальные образцы рН Модель Лэнгмюра Модель Фрейндлиха

qmax, максимальная связывающая емкость, мг/г b, константа сродства, л/мг R2, коэффициент достоверно

сти аппрокси

мации KF, коэффициент связывающей емкости n, коэффициент интенсивности сорбции R2, коэффициент достоверности аппроксимации

Пектат кальция

48,6 кДа 2,0 72,77±11,15 0,0049±0,00021 0,956 0,32±0,14 1,39±0,16 0,803

4,0 105,38±10,13 0,0041±0,00072 0,956 2,78±0,44 1,98±0,11 0,947

6,0 164,02±11,17 0,0043±0,00074 0,967 3,89±0,68 1,90±0,10 0,964

Пектат кальция

15,5 кДа 2,0 75,85±11,79 0,0013±0,00050 0,954 2,36±1,00 2,08±0,31 0,898

4,0 134,13±9,77 0,0057±0,0013 0,956 3,88±0,50 1,96±0,083 0,815

6,0 176,56±8,28 0,0066±0,0057 0,987 6,44±0,56 2,08±0,050 0,909

Пектат кальция 6,8 кДа 2,0 86,35±12,95 0,0082±0,0011 0,952 5,44±1,81 2,55±0,39 0,847

4,0 158,15±11,00 0,0079±0,0022 0,985 8,17±1,42 2,33±0,16 0,889

6,0 202,11±11,39 0,0097±0,0025 0,986 14,39±5,44 2,50±0,39 0,975

Активированный уголь 2,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

4,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

6,0 51,54±7,54 0,0048±0,0020 0,953 1,58±0,05 1,99±0,47 0,900

Полифепан 2,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

4,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

6,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

Микрокристаллическая целлюлоза 2,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

4,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

6,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

Таблица 7

Экспериментальные константы связывания ртути альгинатами кальция с различной молекулярной массой и активированным углем при рН 2,0-6,0

Экспериментальные образцы рН Модель Лэнгмюра Модель Фрейндлиха

qmax, максимальная связывающая емкость, мг/г b, константа сродства, л/мг R2, коэффициент достоверности аппроксимации KF, коэффи

циент связываю

щей емкости n, коэффициент интенсивно

сти сорбции R2, коэффициент достоверности аппроксимации

Альгинат кальция

403 кДа 2,0 30,80±2,76 0,013±0,0070 0,958 2,82±0,48 2,81±0,61 0,780

4,0 65,92±5,12 0,0060±0,0012 0,952 2,16±0,45 2,01±0,15 0,852

6,0 99,96±6,11 0,0044±0,00046 0,953 2,78±0,87 1,93±0,21 0,930

Альгинат кальция

18,0 кДа 2,0 47,57±2,58 0,013±0,0045 0,957 6,68±1,92 3,51±0,52 0,889

4,0 71,80±5,69 0,014±0,0046 0,963 9,50±0,99 3,40±0,22 0,903

6,0 113,40±7,21 0,0096±0,0023 0,980 8,09±1,52 2,59±0,20 0,965

Альгинат кальция

8,1 кДа 2,0 52,45±3,47 0,012±0,0041 0,967 5,23±1,34 2,96±0,32 0,809

4,0 100,35±7,71 0,010±0,0027 0,978 8,07±1,49 2,71±0,24 0,950

6,0 155,33±10,22 0,0083±0,0024 0,979 7,20±2,64 2,19±0,29 0,939

Активированный уголь 2,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

4,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

6,0 51,54±7,54 0,0048±0,0020 0,953 1,58±0,05 1,99±0,47 0,900

Полифепан 2,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

4,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

6,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

Микрокристаллическая целлюлоза 2,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

4,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

6,0 Образец не сорбировал катионы кадмия при данном значение рН

Глава 5

ВЛИЯНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕКТИНОВ И АЛЬГИНАТОВ НА ЭКСКРЕЦИЮ СВИНЦА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Свинец – один из распространенных промышленных ядов, занимающих по уровню мирового производства четвертое место после алюминия, меди и цинка. Ведущими отраслями, использующими свинец, являются электротехническая промышленность, приборостроение, полиграфия и цветная металлургия. В настоящее время в России свинцовая интоксикация среди профессиональных заболеваний занимает первое место [Бурак Ж.М. и др., 2005].

Свинец и его неорганические соединения в зависимости от их агрегатного состояния и характера контакта с ними могут проникать в организм через дыхательные пути (ингаляционный путь), желудочно-кишечный тракт (энтеральный путь) и, частично, через кожные покровы. В производственных условиях наиболее распространенным путем поступления свинца в организм является ингаляционный (в виде пыли, аэрозоля и паров). В желудочно-кишечный тракт свинец и его соединения попадают преимущественно при бытовых интоксикациях, реже – на производствах, при несоблюдении правил личной гигиены [Mackay A.K. et al., 2013].

Поглощенный свинец поступает в кровь и распределяется во внутренних органах в количествах, зависящих от уровня кровоснабжения этих органов и их тропности к металлу. Свинец относится к ядам политропного действия, что объясняет многообразие патогенетических механизмов интоксикации. Ведущая роль среди них отводится расстройствам биосинтеза порфиринов, гемма, ключевых энзимов печени, почек и эритроцитов [Bellinger D.C. et al., 2013; Thuppi V., Tannir S., 2013].



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«О предоставлении жилых помещений в общежитии №7 БНТУ студентам ФГДЭПРИКАЗЫВАЮ:Предоставить нижеследующим студентам факультета горного дела и инженерной экологии, обучающимся на дневной форме получения образования, жилые помещения в общежитии № 7 БНТУ на 2...»

«Всероссийская акция "100 баллов для Победы" в МБОУ СОШ № 19 муниципального образования Тимашевский район 38760401868170190545085В преддверии выпускных экзаменов в стране проходит ставшая уже традиционной Всероссийская а...»

«Протокол об итогах (вскрытие) закупа способом запроса ценовых предложений №39 г.Алматы, пр.Аль-Фараби, 146 12 час. 15 мин. 13 июля 2017 года Организатор / Заказчик: РГП на ПХВ "Научный центр педиатрий и детск...»

«ПЛАН-КОНСПЕКТ УРОКА Тема урока: Размножение и развитие насекомых ФИО (полностью) Оськина Наталья Алексеевна Место работы МБОУ ООШ № 15 г. Ельца Должность учитель Предмет биология Класс 7 Тема и номер урока в теме Размножение и развитие насекомых, 6 урок Базовый учебник Биология. Многообразие живых организмов. 7 класс: учеб. для обще...»

«Рассмотрена и одобрена на "Утверждаю" заседании  МО Директор ГБОУ РМ "Ардатовский Руководитель МО детский дом-школа" _/Галкина Л.Б./ _ /Дубровин С.Б./ "_"2016г. "_"2016г.    Рабочая программа учебного предмета "Биология" в 6 классе.     Составитель: Галкина Л.Б.    201...»

«Хроники Акаши. Подготовка к вознесению материи. Светом ОмТаАРаОм начинаем вещание, вновь диагностируя Световые смыкаемости времен. Это значит, что происходит проникновение в очередной слой сближения и новое обретение, которые некоторы...»

«Технологическая карта урока английского языка во 2 классе Учитель: Гуркина Юлия ЮрьевнаТема урока: "At the circus!" (В цирке!)Цели урока: учить детей рассказывать о цирке; повторить слова, выражающие действие; развивать навыки аудирования, чтения и го...»

«Оснащенность образовательного процесса Группы раннего возраста оборудованы с учетом возрастных особенностей детей и требований САНПиН, оснащены играми и игрушками для детей данного возраста, комплектом методических пособий к комплексной програм...»

«Основные сведения о школе, НКО или молодежной инициативной группе: Название: МОУ "СОШ № 10" Адрес (с указанием индекса): 410031, г. Саратов, ул. Рогожина, 24/32 Телефон (с указанием кода города): 8 (8452) 288201 Электр...»

«МБОУ "Гимназия №14" Научно-практическая конференция по результатам проектной работы Будь здоров, школьник! Автор: Россихина Лариса Анатольевна-учитель химии, руководитель экологического клуба Улан-Удэ 2012 Научно-практическая конференция по р...»

«Тема урока: Что такое природное сообщество? Что такое экология?Цели урока: — формировать представление о природном сообществе, понятии “экология”, систематизировать и обобщить знания о взаимосвязях в природе; — развивать умения устанавливать природные взаимосвязи, прогн...»

«Тест по биологии 8 класс Анализаторы ТЕСТ № 1 Выберите предложения с правильными суждениями.1.Система, состоящая из рецепторов, проводящих путей и зоны коры больших полушарий, называют анализатором.2. Глазное яблоко состоит из внутреннего ядра и окружающих его 3 –х оболочек: наружной, средней и внутр...»

«МБОУ СОШ №6 Исследовательская работа тема: Учебная экологическая тропа "Лес – храм природы" Автор работы: Доценко Ксения Геннадьевна Руководитель: Дроздова Наталья Алексеевна Учитель географии высшей категори...»

«Энергетический обмен1.Основным поставщиком энергии для синтеза АТФ в клетках человека, многих животных и некоторых микроорганизмов являетсяа) глюкоза б) рибоза в) белки г) лип...»

«Дополнительным образованием в школе-интернате охвачено 145% воспитанников, его основными задачами являются: Активизация индивидуальной активности детей, их познавательных интересов; Помощь ребенку в процессе саморазвития, максимальное раскрытие его тв...»

«Автор: Орлова Надежда Трофимовна Учитель биологии МБОУ гимназия №2 г. Сургут ХМАО-ЮГРА Тюменской области Конспект бинарного урока по биологии и географии в 5 классе (ФГОС) по теме: "Путешествие по матер...»

«Дата: Класс 6 Биология. Урок № Тема занятия:.Семейство сложноцветные. Лабораторная работа 25 Общие цели: Формировать знания о признаках растений из семейства сложноцветных. Результаты обучения: Знать строение цветка, соцветия, разнообразие и значение. Уметь характериз...»

«Министерство образования и науки Республики Казахстан КГУ "Школа гимназия" № 93 город Караганда Секция: биология Тема: " Ахатины домашний питомиц или лучший косметолог" Выполнила: Брыкова Эвелина ученица 1 "В" класса, школа гимн...»

«План-конспект урока в 5 классе по учебнику "Биология. 5 класс" Авторы: Сухова Т. С., Строганов В. И. (технологическая карта урока в соответствии с требованиями ФГОС) Составила Вавилкина Л.Б., учитель химии МОБУ СОШ №36 Тема: "Могут ли растения размножаться без семян?" Дата урока...»

«Районный конкурс исследовательских работ и проектов "За страницами ученика 2016" Моделирование биоритмов человека в среде табличного процессора Исследовательская работа по предмету "Информатика и ИКТ" Выполнила:Аксючиц Алина, ученица 6 класса, МОУ "Гуранская СОШ"Руководитель: Савченко Мария Владимировна, учитель инфор...»

«Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение средняя общеобразовательная школа город Вязьма смоленской области Рабочая программа по биологии для 7 класса на 2014-2015 учебный год Учитель: Гусарова Фируза Сабирулловна Рассмотрена на заседании методического совета протокол № _ от "" _ 20 г.Утвержда...»

«Документ предоставлен КонсультантПлюс 30 марта 1999 года N 52-ФЗРОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЗАКОНО САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМ БЛАГОПОЛУЧИИ НАСЕЛЕНИЯ Принят Государственной Думой 12 марта 1999 года Одобрен Советом Федерации 17 марта 1999 года Список изменяющих документов (в ред. Федера...»

«Тема "Save the Earth" ("Спасти планету")Цели: освоить новые лексические единицы в речевой деятельности по теме "Экология" (кислотные дожди). Развивать коммуникативную компетенцию через развитие умений строить повествование в устной речи (использование тезисов) Воспитывать бережное отношение к природе.Ход...»

«МБОУ "Гляденская СОШ" Благовещенского района Алтайского края План – конспект урока географии По теме: "Биосфера – земная оболочка". Разработано учителем Биологии и географии Виноградовой Т.Н. с. Глядень 2013год. ТЕМА: Биосфера – земная оболочка Цели: Создат...»

«Сценарий проекта по с использованием элементов народного художественного промысла.Суетин М.И. Учитель биологии ГБОУ СОШ №277 г. Москва Изучив особенности народного творчества, народных промыслов, предлагаю разработки мероприятий по географии для учащихся старших классов (8-9 классы). Предложенные мероприятия способст...»

«Утверждаю Заведующий МБДОУ д/с №2 "Ромашка" Н.Н.Пинаева ""2017 г. План мероприятий МБДОУ центра развития ребенка – детского сада №2 "Ромашка" Данковского муниципального района Липецко...»








 
2017 www.ru.i-docx.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные документы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.